N-乙酰-D-经氨酸的酶法合成和正选择表达载体的构建.pdf

摘要 摘 要 N一乙酰一D一神经氨酸是化学合成扎那米韦的关键中间体，也是合成其他抗流 感药物的主要原料。目前，N一乙酰一D一神经氨酸主要通过酶催化法制备。首先由 N一酰基一D一葡萄糖胺2一异构酶将N一乙酰一D一葡萄糖胺异构化为N一乙酰一D一甘露 糖胺；从后者到N．乙酰．D．神经氨酸有两个途径：一种是神经氨酸醛缩酶催化 N．乙酰．D．甘露糖胺与丙酮酸之间的缩合而得到N一乙酰一D一神经氨酸；另一种是 神经氨酸合成酶催化N．乙酰．D．甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸缩合为N．乙酰．D． 神经氨酸。 本研究通过同源搜索找到与已知神经氨酸合成酶具有较高同源性的蛋白，进 而在大肠杆菌中进行克隆、表达和纯化。同时测定了不同来源的神经氨酸醛缩酶、 神经氨酸合成酶以及N．酰基．D．葡萄糖胺2．异构酶的活性。结果表明来源于大肠 杆菌的醛缩酶活性最高，以全细胞进行催化，370C下反应1h后，神经氨酸的摩 尔收率最高可以达到23．31％；来源于脑膜炎双球菌的神经氨酸合成酶在全细胞 水平具有很高的合成酶活性，370C下全细胞催化反应30分钟后Neu5Ac的摩尔 收率最高可以达到50．96％：来源于多拟形杆菌的BT0453蛋白的异构酶活性较 好，与大肠杆菌醛缩酶偶联反应，反应时间为4h后，神经氨酸的摩尔收率最高 达到2．77％。 目前将来源自大肠杆菌的三种伴侣蛋白作为融合标签构建了伴侣蛋白融合 表达载体。选取灿13695和I也3348与伴侣蛋白基因融合表达。结果表明，目的 基因与三种伴侣蛋白融合表达的重组蛋白可溶性明显增加，启动因子作为融合标 签的融合蛋白表达量最高。BandScan软件分析表明，all3695基因与启动因子基 因融合表达时，表达出95．5KD融合蛋白，所表达的融合蛋白几乎均为可溶性蛋 白，其可溶性蛋白的表达量占总表达蛋白的比例为37．2％，高于all3695单独表 达时的7．1％的比例；RB3348基因与启动因子基因融合表达时，可溶性蛋白的表 达量占总表达蛋白的比例为53．0％，远高于单独表达时4．4％的比例。 正选择克隆载体是一类通过抗生素或化合物对重组克隆进行直接筛选的载 体，最大优点是其可保证很高的克隆效率，有时可达100％。有报道显示D．内酰 胺酶基因(6肠)在缺失C端密码子(290位色氨酸密码子)时，将不能很好的表达氨 苄青霉素抗性功能；而定向插入外源基因后将重建6肠的C端密码子，进而使B． 内酰胺酶重获氨苄青霉素抗性功能。本研究将色氨酸缺失的p．内酰胺酶基因克隆 至带有nⅣ蛋白酶酶切位点的表达载体上，构建了正选择表达载体pPAE以及 pPAE-ⅧP。选取大肠杆菌醛缩酶似和人源肾素结合蛋白蚴P做克隆范例。 Ⅱ 摘要 实验结果证明pPAE和pPAE．ⅧP的克隆效率均达100％，同时所克隆的基因成 功在大肠杆菌中表达。 关键词：N-乙酰．D-卒申经氨酸，N．乙酰神经氨酸合成酶，活性测定，伴侣蛋 白融合表达载体，正选择表达载体 m Absn．act AbStraCt t0Chenlical N—Acet)rl-D．neuram吐cacid烈eu5Ac)is也ekey血ennediate of of也e铆omedicinesuSedin也e仃ea衄ent0filmuenZ氖 syntllesisZaIla血V近one acidis N—ace够l—D·ne盯{lm越ccunently conSistS procedureof觚steps：first，N—ac啊l—D—91ucos锄ine2唧inler嬲e(AGE) 也e仃a璐fomationof c砌yzes N-acet)r1-D-glucos锄硫