Pseudomnas sp.QR-101生物合成L-半胱氨酸的系统生物学及相关转化途径研究.pdf

中文摘要 中文摘要 半胱氨酸作为含有巯基的氨基酸，它在医药、食品、饲料、化妆品等行业 具有广泛的用途。目前半胱氨酸很难通过微生物发酵来生产，因此一直采用毛 thiazoline-4-Carboxylic sp． QR-101菌株。为了研究Pseudomonas 因转录水平、蛋白表达水平以及代谢物合成和分解水平上的差异，以期找到一 个Pseudomonas sp．QR．101高效合成L半胱氨酸的策略，本论文利用转录组学、 蛋白质组学和代谢物组学的分析方法对Pseudomonos Sp．QR．101的基因转录、 蛋白表达和代谢物进行整体的系统生物分析。 通过比较转录组学的方法对DL．ATC诱导下Pseudomonas sp．QR一101的转 录水平进行分析。结果发现，在诱导和无诱导两组样品的差异表达基因中， 上调，有35个基因发生转录下调。涉及包括能量代谢途径，硫代谢途径，以 DL．ATC为底物合成L半胱氨酸的代谢途径，氨基酸代谢途径等有关细菌代谢 诱导影响最大的一个基因，也是与DL-ATC代谢最为相关的一个基因。．由于该 基因的显著上调，使得菌体内的L．半胱氨酸得到积累，因此与L．半胱氨酸分解 的相关基因也发生了上调。此外，与硫代谢相关的基因发生了转录下调，与能 量代谢相关的基因发生了转录上调。 通过细菌总蛋白进行双向电泳分析，比较Pseudomonas sp．QR一101在DL—ATC 诱导下的蛋白表达差异，并将蛋白丰度差异明显的蛋白点进行质谱测定，进行 比较蛋白组学分析。结果鉴定出9个表达差异较大的蛋白，包括转运系统的鞭毛 蛋白、氨基酸ABC转运系统周质空间结合蛋白，信号转导系统的丝氨酸蛋白激 酶，磷代谢系统的PhoH家族蛋白，氨基酸代谢相关的半胱氨酸合成酶／胱硫醚酶 内酰胺酶、B．内酰胺酶域蛋白。在DL．ATC的诱导下，除了氨基酸ABC转运系统 周质空间结合蛋白表达下调外，其余几个蛋白均为表达上调，涉及细菌代谢活 中文摘要 动的多个方面，使Pseudomogla5 sp．QR．101的整个代谢网络发生了改变，代谢更 加旺盛和积极。 sp． QR-101生物合成L．半胱氨酸时代谢物组学发生的变化情况。利用 01代谢物组样本进行测 UPLC／Q．TOF．MS对有无诱导的Pseudomotla$sp．QR-1 定，通过主成分分析(PCA)的方法，筛查出组间差异性显著的32个潜在生物 标志物。这些代谢物分别属于细菌中不同的代谢途径，主要涉及能量代谢途径 sp． QR．101的代谢过程变得更加旺盛，L．半胱氨酸的积累导致其他氨基酸的合成和 积累水平也受到了影响。 进一步通过液相色谱．质谱联用手段对Pseudomonas 为底物合成L．半胱氨酸的代谢途径进行鉴定，结果表明，该菌株以N．代途径来 sp．QR．101 基因组为模板，通过PCR的方法克隆了编码这三个酶的基因，分别构建到表达载 cold BL21中进行表达，并通过催化实验验证 体pET-28a(+)qa，转化至Escherichia 了三个酶的功能，此外，本论文首次报道了DL-ATC消旋酶AtcA的克隆表达，并 证明了