SOX9与单纯马蹄内翻足相关性研究及其作用机制探讨.pdf

·中文论著摘要· SD唧与单纯性马蹄内翻足相关性研究及其 作用机制探讨 刖 吾 单纯性马蹄内翻足(Idiopathiccongenitaltalipes 严重危害儿童健康的先天畸形之1，发病率在1～8％o。遗传因素在ICTEv的发病 过程中发挥重要作用，其遗传度为65％。但其遗传方式、外显率等均不清楚，易 感基因尚未确定。目前研究较多的与IcTEV发病相关的基因主要集中在与足踝部 骨骼、软骨、肌肉和神经发育相关的基因，如C观鲥J『，C，4即J『D，删丁劢，H创∞J3， Ⅸ口勿办口』(C说鲋J)基因簇内的7个多态位点进行分析，提示c毗鲥J基因可能是 及蛋白水平的表达情况进行研究，结果显示患儿C说鲋J表达明显增加。用 PCR．SSCP方法进行C说鲥J『基因近端启动子突变筛查，亦没有发现突变。之后 我们分别构建了C说鲋J7基因近端启动子系列截短荧光素酶报告基因载体，转染 Bel细胞系、823细胞系、人成纤维细胞系，转染结果提示：C说鲋J基因上游一559 到．403之问、．275到．195之间可能存在着正调控元件。接着缺失型及突变型荧光 素酶表达载体荧光素酶活性检测结果提示：C说鲋J『基因近端启动子的一257至．275 之间可能是C说鲥J『基因的诈调控元件，又应用P．MATCH软件预测此区域有转 录因子SRY-related box hi曲mobility酉oupgene9(SOX9)的结合位点。 S0卿基因是S似基因家族中重要的一员，作为转录因子，其在脊椎动物生 长发育过程中起着重要的作用，尤其在人和哺乳动物性别决定和软骨生成中起着 关键的调控作用。人的S0眇基因定位于17q23，其转录产物长4．3kb，编码含509 dysplasiaCD)致病基因被鉴定出来。如果SO姻发生突变或SO姻基凶的单倍体 不足就可以导致CD。CD是一种罕见的先天性软骨发育异常综合症(国外报道发 病率为0．5～1／10万)，表现为骨骼发育障碍伴随xY性别逆转，属常染色体显性 遗传病。sQ椤在骨和软骨发育中起关键作用。体内、外实验证明：在人软骨细胞 中，SOX9能以转录因子形式结合C说刎J、C毗鲥J『、C说2纠』或软骨基质蛋 白．1基因(尬们，砌一J『)等基因上游相应SOX9结合位点，从而来调控其基因的表达， 这种结合是通过位于SoX9蛋白N端附近二聚体域介导的，而不是HMG域。此 区域突变降低了它们的结合力从而导致cD。 本研究旨在探索Sa唧基因是否与ICTEV畸形发生相关，SOX9蛋白能否与 C说鲥J『上游预测的结合位点结合，以及在ICTEV发生过程中S0卿基因是否受 其它基因的调控。 方 法 要为胭长屈肌)标本由中国医科大学附属第二临床医院小儿外科提供，9例同龄正 常对照(非ICTEV患者)足踝部肌肉组织(主要为胭长屈肌)由中国医科大学法 医学院提供。2例踝关节开放型外伤患者清创剔除的部分肌肉及软骨组织由沈阳 市奉天医院骨外科提供。所有标本使用均经患者知情并同意。 1、用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)检测^5『Q矽基因外显子及 转录起始点上游1100bp序列突变 PCR扩增84例患者SD椤基因2个外显予以及Sn矽基因转录起始点上游 1100bp序列，应用20％～80％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛查上述片段突变情况。 2、分别用I汀．PCR、real—timeI汀．PCR方法、免疫组织化学染色和 ICTEV患者足踝部肌肉表达情况 分别提取ICTEv患者及对照足踝部肌肉组织的RNA，应用RT-PCR及 real—time 足踝部肌肉组织切片，应用免疫组织化学染色技术，观察sOx9蛋白的表达部位； 2 SOX9蛋白的表达情况。 患者足踝部肌肉组织的表达 制作ICTEV患者及对照足踝部肌肉组织冰冻切片，经常规处理后用SOX9兔 多克隆抗体及cOL9A1鼠多克隆抗体共杂交，用FITC标记羊抗兔荧光二抗及 TRITC标记羊抗鼠荧光二抗杂相应抗体，应用激光扫描共聚焦显微镜同时观察 SOX9蛋白及COL9A1蛋白的表达部位。 4、用染色质免疫沉淀实验(ChIP)在体内验证SOX9蛋白与 C说鲋』基因启动子区预测SOx9结合位点结合作用 将踝关节外伤患者清创剔除的肌肉及软骨组织