PMI筛选体系建立及MHA-MLTB融合基因在百脉根中的表达.pdf

摘要 广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在 风险，因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因 (phosphomannose 外的生物界，但在植物中只有肉桂和大豆等存在。 全球肆虐的禽流感不但给家禽养殖业造成了重大经济损失，同时也己严重威胁着人类健康。 禽流感血凝素是主要的抗原蛋白。大肠杆菌不耐热毒素BⅡ基(m)能刺激肠道上皮细胞，增 强黏膜细胞对抗原通透性，从而增强免疫反应。本实验以构建禽流感血凝素MHA基因和大肠杆菌 热敏毒素B弧基基因MLTB融合表达载体，并以刷垣，作为筛选标记，添加脱懈表达调控元件，转化 1．设计了27种不同甘露糖和蔗糖浓度配比，观察百脉根外植体在不同浓度梯度培养基中分化的 情况，以测定外植体对甘露糖的耐受浓度。将外植体置于不同甘露糖浓度的MS培养基中培养 30d后，测定不同浓度梯度下的外植体鲜重和出芽率。在同一蔗糖浓度下，随着甘露糖浓度的 升高，外植体鲜重呈递减趋势，同时外植体分化率大幅下降，出芽数量减少，芽也冈受抑制 生长发育迟缓；当甘露糖浓度达到209／L之后，外植体的鲜重平均下降了80％，且外植体已不 再分化，并逐渐黄化枯死。将百脉根种子置于不同甘露糖浓度的培养基中，2周后发现随着甘 露糖浓度的增加，发芽率逐渐降低，生根受到抑制，根系变短；当甘露糖浓度达到159／L．主L后， 生根完全受到抑制。依据上述研究数据确定筛选浓度，从而建立了删选体系。 记获得转化率为23％。结果表明删选标记可代替传统的抗生素抗性标记并成功应用于百脉 根，在国内外尚属首例。 禽流感血凝素MHA基因和大肠杆菌热敏毒素BⅡ基基冈MLTB，利用基因重组技术，构建 表达载体pCAMBIAl302、PMI筛选标记、核基质结合区MAR 基因、MLTB基因、NOS终止子)。 过氯酚红法对获得的转基冈植株进行酶活测定。结果表明，目的基因在百脉根中稳定表达。 关键词：磷酸甘露糖异构酶，禽流感血凝素，大肠杆菌热敏毒素B亚基，百脉根，转基因 Abstract been forselectionof Selectablemarkersbasedonantibioticorherbicideresistancehave used widely in their riskstOtheenvironmentandhumanhealth transformation，but transgenicplantsplant potential limitedtheir asbiosafemarkers．Selectablemarker PMl to application systemusing geneencoding issuchallavailablecandidateofnon--resistancemarker phosphomanose—·isomerase(PMO system．PAIl exists in and to bacteria,yeastanimals．However,most widely plants，excepting andseveralother noPMl legumes plants．havegene． Globaloutbreakofbirdflunot leadstoeconomic alsothreathumanhealth in only