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在具有高转移倾向的非小细胞肺癌细胞中+58CpG 位点的甲基化能够降低DCN 基因的表达从而增强TGF- β信号通路 中文摘要 中文摘要 背景和目的：肺癌是全世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌分非小细胞 肺癌（NSCLC ）和小细胞肺癌（SCLC）；其中 NSCLC 在所有肺癌中约占 85 ％。 由于在实体瘤患者中，90 ％的癌症死于转移，因此阐明潜在的肺癌转移机制显得 尤为重要。转化生长因子 β （TGF-β）是细胞生理过程中普遍存在的、重要的调节 因子，如调节细胞的增殖，迁移，侵袭和免疫监视。核心蛋白聚糖（DCN ）是存 在于细胞外基质的、富含亮氨酸的、小分子蛋白聚糖家族的成员。它可以特异地 结合 TGF-β并部分阻断 TGF-β的信号传导途径，从而抑制远端肿瘤，包括肺癌在 内的细胞生长。然而，对于何种机制导致DCN 的低表达并促进肺癌的转移尚不清 楚。在我们的研究中，我们探讨了在转移的 NSCLC 细胞中，DNA 甲基化这一表 观遗传学因素是否能够导致 DCN 失活并影响 TGF-β/Smad 信号通路。 方法：（1）、检测低转移的 95C 和高转移的 95D 非小细胞肺癌细胞的迁移和侵 袭能力。（2 ）、以 β-actin 为内参，用 q-PCR 检测 DCN 的表达，验证DCN 的表达 是否会随着细胞转移能力的增强而降低。（3 ）、用浓度为 10um 的 5-Aza 去甲基化 药物处理 95C 和 95D 细胞。5 天后提取细胞DNA 和 RNA 检测 DNA 甲基化和DNC 4 ）、选取DCN 基因近端启动子（-200 ~ +1 ）和5-UTR (+1 ~ +1,030) 基因表达的关系。（ 共 1231bp 片段，并用 Methyl Primer Express® Software v1.0 和 TFSEARCH 软件预 测含有转录因子结合的 CpG 位点。（5 ）、用 95C、95D 细胞和 III 和 IV 的非小细胞 肺癌病人组织验证预测的功能性+58CpG 位点甲基化与DCN 表达之间的关系。（6 ）、 用 Western Blot 检测转录因子 AHR 在 95C 和 95D 细胞中是否表达。（7 ）、在 95C 和 95D 细胞中，用 ChIP 方法分析 AHR 能否与+58CpG 位点结合。（8 ）、用 EMSA 以及构建荧光素酶报告基因来验证+58CpG 位点甲基化能够降低 AHR 的结合能 力。（9 ）、ELISA 实验检测 DCN 蛋白的表达水平。（10）、用磷酸化的 SMAD3 与 SMAD3 之间的比值以及EMT 标记分子 E-cadherin 来衡量 TGF-β通路的活性水平。 结果：（1）DNA 甲基化参与了DCN mRNA 的表达。（2 ）经软件预测，+58CpG 位点是一个潜在的功能性 CpG 位点。(3) 在转移的 NSCLC 细胞中，95D 细胞的 +58CpG 位点甲基化频率明显高于 95C 细胞，而且与 DCN 的表达具有相关性。（4 ） I 中文摘要 在具有高转移倾向的非小细胞肺癌细胞中+58CpG 位点的甲基化能够降低DCN 基因的表达从而增强TGF- β信号通路 AHR 能够与DCN 基因 5′-UTR 区的+58CpG 位点结合。（5 ）+58CpG 位点的甲基化 能够影响转录因子与DCN 基因 5′-UTR 区的结合能力。（6 ）+58CpG 位点的甲基化 能够抑制荧光素酶报告基因的活性。（7 ）在转移的 NSCLC 细胞中，DCN 抑制了 磷酸化的 SMAD3 并增强了 E-cadherin 的表达。 结论：在这项研究中，我们发现了在高转移性非小细胞肺癌细胞中，DCN 基 因5-UTR 区甲基化的+58CpG 与DCN mRNA 表达降低有关。我们的研究结果显示， +58CpG 甲基化可能是导致AHR 低招募到 DCN 5-UTR 区的机制之一，从而促进 TGF-β/Smad 信号增强磷酸化 Smad3 蛋白表达，最终下调 E-cadherin 的表达。 关键词：非小细