增强子位点突变GFP报告基因表达影响及生物信息学分析.pdfVIP

中文摘要 增强子位点突变对GFP报告基因表达影响及生物信息学分析 摘 要 基因表达的机理尚有许多值得研究之处。本研究室前期工作证明， 7 5 7 7 为什么类似的序列活化基因作用不同，为弄清碱基片段和单个碱基在 7． 活化基因中的作用，我们对22R序列进行突变，发现AA(5 (5 AA中的其他T碱基是否也参与活化基因过程呢?于是又对AA序列中的 第2、第1 报告基因表达的影响。 方法：1引物和作为模板的DNA片段设计带有适当酶切位点的引 物和DNA片段模板，委托DNA合成公司合成。表1列出本文中合成的 引物和作为模板的DNA片段。 2重组质粒构建 以人工合成的带有突变位点的序列为模板，用带有 适当酶切位点的引物扩增目的片段，酶切后插入pEGFP．C1质粒，获得插 入1个目的片段的重组质粒(×1重组质粒)，用HindIII／XbaI酶切×1 I酶切×l重组质粒，胶回收小 重组质粒，胶回收大片段，用HindIII烈he 片段，用T4DNA连接酶连接大、小片段，得到同向二串连体插入质粒(× 2重组质粒)。将×2重组质粒用HindIII／NheI酶切，胶回收小片段，连 入经HindIII／Xba 游同向、正向插入14个Alu)的GFP和串联Alu序列之间。 中文摘要 染HeLa细胞，荧光显微镜下计数GFP荧光阳性细胞比例并照相。 4流式细胞分析委托河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞 分析室完成。 结果：1重组表达载体构建和鉴定重组表达载体经酶切和测序鉴定 正确。 2 光显微镜观察并计数。荧光细胞阳性率六次试验均值分别为： C1-AA×2-Alul47．394-0．91％，C1一Alul4 80．50+1．33％。 果计算强荧光细胞的比例(荧光强度102的细胞数／总的细胞数)，荧光阳 性细胞百分数分别为5．O％和0．1％。这些结果与荧光阳性计数结果呈一致 性。C1．AAx2．Alul4能解除Alul4对GFP基因的抑制作用。 3 AA序列点突变对GFP基因表达的影响AA序列点突变后重组 质粒分别转染到HeLa细胞做荧光显微镜观察并计数，荧光细胞阳性率六 次试验均值分别为： C1．AA№x2．Alul43．59+0．27％，C1．AAMFCx2．Alul45．78+1．09％， C1．AAMFGx2．Alul42．95+0．70％，C1．AAMSeAx2．Alul44．02+1．06％， C1．AAMSeCx2．Alul44．28+1．29％，C1一AAMSeG×2-Alul43．70士0．86％， C1-AAMThAx2．Alul47．09+1．60％，C1．AA^压ThCx2．Alul45．25-4-1．33％， C1-AAMThGx2．Alul43．02+0．74％，Cl—AAx2．Alul47．394-0．91％， C1-Alul41％。 0．69+0．1 流式细胞仪测定结果显示，如果计算强荧光细胞的比例(荧光强度 102的细胞数／总的细胞数)，荧光阳性细胞百分数分别为： C1．AAMFIAx2．Alul41．87％，C1．AAMFCx2．Alul44．22％， C1．AAMFG×2．Alul4O．96％，C1．AAMSeAx2．Alul42．35％， C1．AAMSeCx2．Alul42．67％，C1一AAMSeGx2一Alul42．58％，