壳聚糖对去乙酰菌环氧乙酯合成的调节作用.pdf

摘要 摘 要 海洋微生物生境特殊，具有独特的代谢途径。海洋微生物的次级代谢产物是新药 物研究开发的重要资源。如何提高微生物的次级代谢产物的产量，是目前海洋微生物 开发亟待解决的问题。近年来，使用诱导子来刺激代谢途径已经成为提高目的产物产 量的主要策略之一。’ 本论文尝试采用诱导予来提高海洋抗肿瘤候选新药去乙酰真菌环氧乙酯 是红树植物内生真菌A sp．A123)产生的一种骨架新颖的环氧二烯类化 123(Phomopsis 合物。前期研究表明，DAM具有较强的细胞毒性，对gaji细胞株ICso为3．0pg／mL， 对胃癌AGS细胞株IC50为1．0 I-tg／mL，具有较好的药用开发前景。但是野生菌株发 酵产量极低，PDA固体发酵产量仅为0．8 mg／L，限制了对DAM的进一步研究。 在前期摇床培养基质优化的基础上，本文选择和制备了16种诱导子，研究了它 们在液体培养条件下对DAM高产突变株139的DAM产量的影响，结果表明，白色 假丝酵母菌体制备物和壳聚糖具有显著的正调节作用。采用CCD设计响应面实验， 得到了壳聚糖诱导子的最佳诱导条件：壳聚糖接种时间为发酵后的144h、浓度100 mg／L。DAM最高产量可比空白对照提高36％。进一步对诱导条件进行优化，DAM 的终产量可以提高1．5倍，为工业生产上提高DAM产量、缩短生产周期奠定了基础。 为了研究壳聚糖对菌株139诱导过程中发生的生理生化变化，本文对实验组和对 照组发酵液分别进行了生物量、DAM产量、残糖的测定以及菌体形态观察的实验。 结果显示壳聚糖的加入促进了菌株的一些生理变化，尤其是菌体提前产生了自溶现 象。 采用Real．timePCR等技术，初步探讨了壳聚糖提高DAM产量的可能机制。通 过简并引物设计，从菌株139中克隆出信号转导蛋白的保守片段，得到G蛋白的a 亚基、MAPK蛋白和PKA蛋白的保守序列；通过Real．timePCR检测得出G蛋白的 h、2 表达量在诱导2h内基本没有变化，5h下调了5．89倍。而MAPK蛋白在诱导l h、5 h时分别下调了1．49、2．28、10．57倍；推测诱导作用可能是通过信号转导途径将 外界信号传递到细胞核，导致相关基因转录水平变化。其次，在前人研究基础上，探 究壳聚糖的加入对DAM合成相关酶的表达变化影响，发现酯酶、细胞色素P450单 h和第216 氧合酶和NAD依赖性的脱水酶这3种后修饰酶在发酵第168 h时伴随着 摘要 DAM产量的提高均有不同程度的上调。因此推测壳聚糖提高DAM产量的机制可能 最终是上调了DAM合成相关基因的转录水平，进而促进DAM的合成。 关键词：诱导子；去乙酰真菌环氧乙酯；壳聚糖 Ⅱ Abstract Abstract their often Becauseof conditions，marine produce specialliving microorganisms bioactive withnovel and of various substances functionsstructures．However,theyields