外源基因在转基猪中遗传和表达的稳定性.pdf

I ； 目 录 目 录 中文摘要………………………………………………………………………………………………．．1 英文摘要………………………………………………………………………………………………III 1．前言……………………………………………………………………………………………………l 1．1转基因动物研究概况………………………………………………………………………。l 1．1．1转基因动物的生产方法…………………………………………………………………l 1．1．2转基冈动物的检测………………………………………………………………………5 1．1．3转基冈动物的发展前景及存在的问题………………………………………………．1l 1．2表观遗传修饰对外源基因表达的影响……………………………………………………13 1．3外源基因的位置效应………………………………………………………………………17 1．4外源基因的遗传……………………………………………………………………………19 1．5本研究的目的意义…………………………………………………………………………21 2．材料与方法…………………………………………………………………………………………．22 2．1实验材料……………………………………………………………………………………22 2．1．1实验动物………………………………………………………………………………．．22 2．1．2工具酶及试剂盒………………………………………………………………………。22 2．1．3主要试剂…………………………………………………………………………………23 2．1．4主要仪器设备…………………………………………………………………………．24 2．1．5主要生物学分析软件…………………………………………………………………．25 2．2实验方法……………………………………………………………………………………．．25 2．2．1猪成纤维细胞的分离培养……………………………………………………………．25 2．2．2猪成纤维细胞药物处理及活率分析…………………………………………………。26 2．2．3流式细胞分析术………………………………………………………………………．26 2．2．4基冈组DNA及总eDNA的获得……………………………………………………。27 2．2．5Southern blot……………………………………………………………………………………………………．29 2．2．6Western l blot………………………………………………………………………………………………………3 2．2．7 Q-PCR……………………………………………………………………………………………………………．．34 2．2．8亚硫酸氢盐测序………………………………………………………………………．37 2．2．9染色体免疫共沉淀……………………………………………………………………．41 2．2．10外源基冈拷贝数的检测………………………………………………………………42 2．2．1 l外源基因整合位点的检测……………………………………………………………43 2．2．12数据统计分析…………………………………………………………………………46 3．结果…………………………………………………………………………………………………………………………………47 3．1TSA和50AZA-dC对外源基冈表达和表观遗传修饰的影响……………………………47 3．1．1 TSA和5-AZA．dC处理猪成纤维细胞方法的筛选…………………………………．47 3．1．2 TSA和5-AZA．dC处理对外源基因在转基因猪成纤维细胞中表达的影响………．49 3．1．3 TSA和5-AZA-dC处理对外源基因启动子区表观遗传修饰的影响………………．52 3．1．4 TSA和5·AZA-d