大鼠单克隆抗体台的初步建立及应用.pdfVIP

摘要(Abstracts) 摘 要 大鼠．大鼠杂交瘤是继小鼠杂交瘤之后发展起来的另外一种单克隆抗体制备 技术，其与小鼠杂交瘤技术相比，具有独特的优势，如抗原识别谱广、抗体产量 高、可用于小鼠抗原的研究等，故其作为小鼠杂交瘤技术的良好补充，具有极大 的科研价值和良好的应用前景。 在小鼠单克隆抗体制各过程中，对于小鼠免疫效果的评价，目前采用的方式 均为检测免疫小鼠的抗血清滴度，其结果仅能够反映小鼠常规免疫阶段的体液免 疫应答，而不能够反映小鼠细胞免疫应答及最后一次加强免疫(尾静脉注射、脾 免)的效果，但最后一次加强免疫对杂交瘤制备时的融合阳性率及后期所得单抗 亲和力性质等方面均有着至关重要的影响，因此，有必要对此种免疫评价方式加 以完善。IFN．Y是主要由激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，研究表明，内 源性IFN．丫水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，所以通过对 小鼠脾细胞经免疫原刺激后分泌IFN—Y水平的定量检测，可以更加准确地评价 小鼠的免疫效果。 本研究从国外引进Lou／C大鼠鼠种，并对大鼠免疫、细胞融合、细胞株克隆 化、腹水生产及纯化等一系列实验条件进行摸索，成功建立基于大鼠．大鼠杂交 瘤技术的大鼠单克隆抗体制备平台，并利用该平台制备了大鼠抗小鼠IFN．Y单 克隆抗体，进而建立起定量检测小鼠IFN—Y的双抗央心ELISA方法，用于小鼠 细胞免疫效果的评价。 首先，利用重组蛋白作为抗原，以不同的免疫方式(皮下注射、腹腔注射) 对Lou／C大鼠进行常规免疫，通过抗血清滴度跟踪检测初步评价免疫效果进而确 定免疫方式；对大鼠淋巴瘤细胞系YB2／0进行Lou／C腹水诱导验证，确定其可 用于大鼠杂交瘤细胞制备，同时对其与大鼠脾细胞的融合条件进行一系列摸索， 初步确定了最佳融合方案，保证细胞融合率；采用有限稀释计数法对杂交瘤细胞 进行连续克隆化得到稳定杂交瘤细胞株，并尝试进行Lou／C大鼠腹水诱导；摸索 并确定从大鼠腹水中纯化单抗的方法，对所得单抗进行初步评价，最终成功建立 起完整的大鼠单克隆抗体制备平台。 T 摘要(Abstracts) 其次，采用RT-PCR方法从小鼠脾脏细胞中扩增出小鼠IFN．Y全长eDNA 序列，以该产物为模板，进一步PCR得到编码小鼠IFN．Y成熟蛋白的DNA片 达并利用离子交换层析纯化得到纯度90％的目的蛋白。用商品化的mlFN．Y ELISA检测试剂盒对目的蛋白进行检测，结果显示目的蛋白与单抗具有良好的反 应性，可作为免疫原用于大鼠免疫及抗体制备。 最后，利用重组表达mlFN—Y免疫Lou／C大鼠，制备得到5株大鼠单抗，并 进行HRP标记；利用方正滴定法筛选出可用于mlFN．Y检测的最佳单抗配对 蛋白，结果显示二者灵敏度相当，检测结果无显著差异。 总之，本研究初步建立了大鼠单克隆抗体制各平台，并利用该技术制备得大 鼠抗小鼠IFN．Y单克隆抗体，建立了夹心ELISA检测小鼠IFN．Y的方法，可应 用于小鼠细胞免疫效果的评价。 关键词：大鼠杂交瘤；单克隆抗体；小鼠IFN．Y；ELISA 摘要(Abstract) Abstract Ratxrat isanothermethodfor monoclonal hybridomatechnique preparing antibodies．Itseveral overthemouse possessesadvantages hybrids，forexample，the ofserumandasciticfluidis betterthanmiceto yield may higher,ratsrespond ra