大鼠原代系膜细亚细胞组分的蛋白质组学研究.pdfVIP

摘要 摘要 背景与目的：蛋白质组学(proteomics)是指在一个细胞的整个生命过程中 由基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质。蛋白质组学可以通过对细胞内 所有蛋白质进行大规模的研究，真实的反映机体内环境的情况，揭示疾病的发 病机理，为疾病早期诊断提供特异性的标志物。细胞亚结构蛋白质组是最近新 发展起来的蛋白质组学，通过研究细胞亚结构蛋白质，可以明确蛋白质的具体 定位，以及蛋白质在不同亚组分中的转运与细胞功能的关系，对于阐明细胞的 功能调控机制有非常重要的作用。系膜细胞是肾小球的基本组成细胞之一，许 多肾小球肾炎如糖尿病肾病、IgA肾病等都能够引起系膜细胞的异常。本研究 通过研究正常系膜细胞亚组分的蛋白质组学，建立系膜细胞亚组分蛋白质表达 谱，初步分析各组分蛋白质的生物学功能，揭示蛋白质调控系膜细胞功能的作 用机制。 方法： (1)大鼠的原代系膜细胞的分离提取和鉴定：利用筛网技术，首 先得到纯化的肾小球，经Ⅳ型胶原酶消化，获得原代系膜细胞，培养至8．10 蛋白质：利用碧云天细胞亚组分抽提试剂盒分离提纯系膜细胞浆蛋白、细胞膜 蛋白、细胞核蛋白。western 的表达。(3)胶内酶解：蛋白质经10％SDS．PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，将 各亚组分电泳条带胶块切割成12段，并用胰蛋白酶酶解。(4)质谱鉴定：采用 Server Global UPLC．QTOF(Waters公司)液相质谱进行鉴定，采用proteinLynx version 2．4进行数据处理软件，最后用NCBI大鼠数据库进行检索。(5)生物 信息学分析：利用BINGO软件对各亚组分蛋白质进行细胞成分分析，采用博 奥公司的MAS软件分析各亚组分的蛋白质生物学功能。(6)细胞骨架定位的 验证：利用免疫荧光和Westernblot验证SEPT2和F．Actin的表达。 结果： 细胞胞浆里表达，证明提取细胞为系膜细胞；(2)细胞亚组分纯度验证，Western 均有，TBP在细胞核与细胞浆内均由表达。证明各亚组分取其它组分污染。(3) 亚组分蛋白质的生物信息学分析：共鉴定出细胞浆蛋白993个，其中新发现细 l 摘要 胞浆蛋白292个；细胞膜蛋白647个，其中新发现细胞膜蛋白382个：细胞核蛋 白740个，其中新发现细胞核蛋白451个。这些亚组分蛋白质协同参与调控细 胞骨架的调节、代谢进程、转录与翻译、信号转导、物质转运及应激等生物功 能。(4)细胞骨架蛋白蛋白F．Actin和SEPT2的验证。Weseternblot和免疫 荧光结果显示，F．Actin和SEPT2在细胞浆蛋白、细胞膜蛋白、细胞核蛋白均 有表达，与质谱检测数据一致。 结论：本实验采用了SDS．PAGE／LC．MS技术，成功的获取了各亚组分的蛋 白质表达谱，并发现了新的亚组分蛋白质。这些亚组分蛋白质协同参与了生物 学功能的调控。其中细胞骨架蛋白F．Actin、SEPT2在细胞浆，细胞核和细胞膜 上表达，不仅参与了细胞骨架的调控，可能还参与了细胞核和膜的生物学功能 调控。 关键词：系膜细胞；蛋白质组学；质谱 Abstract Abstract and researchesall modified Background objectives：Proteomicsproteinsincluding proteins thelifecourseofacell．The could during proteomicsexplorelarge-scaleproteinsexpression can torevealthe ofdise