小鼠三种胚胎干胞系表观相关基因的分析.pdf

摘 要： 细胞核的重编程可以通过将体细胞的细胞核移入卵母细胞，将体细胞和胚胎干细胞 进行融合，以及向体细胞中转入几个转录因子例如Oct4, Sox2, C-myc, Klf4 和 Nanog 的方法实现，然而细胞核的重编程需要经历复杂的过程，其中最为重要的就是细胞核所 发生的表观遗传学变化，本文主要综诉了细胞核重编程的研究概况，产生干细胞的四种 不同的方法和现代表观遗传学中干细胞的表观遗传学特性以及体细胞的表观遗传学变 化。 我们从培养 ES 细胞着手，通过一年的摸索初步建立了小鼠胚胎成纤维细胞的体外 培养平台，并在此基础上利用小鼠胚胎成纤维细胞经过丝裂霉素c 处理的方法建立了合 格的胚胎细胞滋养层。同时综合国内外文献，采用对小鼠注射激素，超数排卵，冲取3.5 天的受精卵，接种于小鼠胚胎成纤维细胞制作的滋养层细胞上，在体外培养下使受精卵 正常发育，并孵化，进而使受精卵在体外贴壁，等内细胞团长大时用机械的方法挑取内 细胞团，从而建立了三株小鼠的胚胎干细胞系，经过分子水平的鉴定，基本确定细胞系 的成功。 基于胚胎细胞完整的培养体系，我们成功培养了ES 细胞系，核移植胚胎干细胞系， IPS 细胞系各两株，在实验室培养扩大后分别提取了各个细胞系的总 RNA。在此基础上 设计定量引物，分别分析了与胚胎细胞表观相关的表观遗传学基因，主要包括与DNA 甲 基化相关的基因Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L、Aicda、与H3K27me3 相关的基因Ezh2 Kdm6b Kdm6a，与H3K4me 相关的基因 mllI LSDI 与Histone Ac 相关的基因Kat2a，以一株细 胞ES 细胞系作为对照，利用2-△△Ct 法分析了这些基因在六株细胞系中的变化，结果 显示，在6 个细胞系中ntES2 在各个基因中都比同类以及其他细胞系表达量要高，特别 是在Dnmt1 基因中要比同类细胞高出5 倍多，由于此细胞在体外传代次数较长已达到25 代，因此有可能在体外传代过程中引起细胞表观修饰的改变，此现象已在文献中有报道， 对于此细胞系进一步的鉴定还需要进行。 与H3K27me3 相关的基因 Ezh2、Kdm6b、Kdm6a、与H3K4me 相关的基因 mllI LSDI 与Histone Ac 相关的基因Kat2a 在六个细胞系中的表达量均未表现出变化。 与DNA 甲基化相关的基因中，Dnmt1 基因在各个细胞系中的表达没有表现出很明显 的变化，而Dnmt3b 基因在两株IPS 细胞系中的表达量要比正常的ES 细胞和核移植干细 胞系低将近2 倍。相反，Dnmt3L 基因在两株IPS 细胞系中的表达量比正常的ES 细胞和 V 核移植ES 细胞系高将近 4 倍。单从与DNA 甲基化相关的DNA 甲基化转移酶来说，IPS 细胞系与正常的 ES 细胞系和核移植干细胞系在这方面还是存在着不同的表观现象，从 另一个角度来说，细胞的重编程程度上存在差异。 关键词：重编程 表观遗传学 诱导多能干细胞 DNA 甲基化 VI Abstract Somatic cells can be reprogrammed through transferring nuclear contents of somatic cell into oocytes, or by fusion with embryonic cells, or inserting several transcription factors (Oct4, Sox2, C-myc, Klf4 and Nanog) into somatic cell genome. This is a complex progress in which the most important is the epigenetic changs of the cell nucleus Here we discussed the recnt advance in the reprogramming of cell nucleolus, four different approach to generate embr