抗炎药物筛选与型娃儿藤碱衍生物NK-007在胶原诱导关节炎模型中作用机制研究.pdf

中文摘要 中文摘要 类风湿关节炎是一种慢性的炎症性多发性关节炎，它能影响任何具有滑膜 结构的可动关节处的关节，尽管发病部位更加倾向于手的腕关节和小关节。类 风湿关节炎的典型自然史是进程性的关节损伤导致关节变形和失去活动能力。 最近，在诠释滑膜炎和关节损伤的机制方面已经取得大量的进展。实际上，对 于TNF．伐在关节炎症和损伤中起着重要作用的认识使得治疗的引入，那就是靶 向TNF．c【，并且对于患有关节炎病的治愈具有重要的影响。 我们的前期工作发现DCB．3503可以通过影响固有免疫细胞治疗小鼠的类 风湿关节炎发病。基于这一现象，我们以DCB．3503为先导化合物，在此基础上 进行了化学结构的修饰，合成了一系列的衍生物，并建立以重要炎症因子TNF．Ⅱ 为靶点的药物筛选方法。在反复实验稳定药物筛选体系后，我们对多批化合物 了原先导体的不稳定性，并提高了化合物的水溶性，使其更加具有临床应用性。 为验证NK．007的抗炎作用，我们在体外通过不同途径、选择不同细胞对其 进行研究。首先使用ELISA方法检测NK．007处理后的小鼠原代脾脏细胞以及 小鼠单核．巨噬细胞系，在LPS刺激条件下TNF．Q表达的改变。并分别使用流式 细胞术与蛋白免疫印记对NK-007的拮抗作用进行验证。NK-007显著抑制小鼠 原代脾脏细胞，小鼠单核．巨噬细胞系体外经LPS刺激后TNF—O【蛋白的产生，并 且这种抑制作用呈现一种明显白勺i剂量时间依赖效应。 接下来，我们在体内通过建立小鼠胶原诱导的关节炎模型(加入或不加入 LPS加剧关节炎进程)，进一步探讨NK-007的抗炎作用。在小鼠二次免疫后不 同时间点观察关节炎发病的症状，在关节炎发病症状达到平台期时取小鼠关节 行HE染色，通过病理切片与病理评分评价NK-007的作用；并在小鼠发病急性 期使用荧光定量PCR进行关节局部细胞因子表达检测，使用免疫组化进行关节 局部TNF．Q表达检测，取小鼠脾脏与引流淋巴结细胞分析小鼠免疫状态的改变。 实验结果显示，与对照组相比，经过NK．007治疗后的关节炎发病小鼠，其发病 被阻滞或发病的症状显著被减轻，发病时间延后。进一步的分析提示，NK．007 中文摘要 抑制了关节处炎症因子如TNF．钆IL一6以及IL．17等的表达，抑制关节炎发病小 鼠腹腔巨噬细胞产生TNF．0【的功能，并且降低发病小鼠引流淋巴结中Thl7细胞 亚群的比率。 为继续深入的对NK．007发挥其抗炎作用的具体机制进行探讨，我们对 NK-007作用后的细胞进行分析。使用荧光定量PCR和荧光素酶活性检测实验均 转录本稳定性。因此，以蛋白质印记法检测NK．007在影响TNF．Q转录本稳定 性信号通路中的作用，我们发现NK-007能够显著降低p38蛋白磷酸化，降低其 底物MK2的表达，并进一步促进其下游效应分子TTP的升高，后者结合于TNF．旺 转录本，使其更加容易被降解。 为了解释类风湿关节炎发病小鼠体内Thl7亚群降低的现象，我们对NK．007 处理过的树突状细胞进行分析，发现NK一007显著下调树突状细胞IL．6的产生。 这一现象提示我们，NK．007可以通过作用于树突状细胞，影响IL-6分泌从而间 接抑制Thl7的分化，而事实上，使用NK-007处理过的树突状细胞来源的上清 液的确诱导产生更少量的Thl7细胞。除此之外，流式细胞术检测NK．007对Thl7 分化还有着直接的拮抗作用。最后，通过体外共培养实验与ELISA检测，我们 与IL．6的分泌。 基于NK．007在体外对TNF．位产生与Thl7分化的抑制以及在体内关节炎模 型中对发病的预防及治疗效应，NK．007很有可能成为治疗人类类风湿性关节炎 的潜在药物前体。 关键词：类风湿关节炎，TNF．仅，IL．17，NK．007，治疗。 Abstract thatcanaffect ac11romc Rheumatoid inflammatorypolyarthritis amlritis(RA)is