拟穴青蟹过敏原性质研究.pdfVIP

拟穴青蟹过敏原的性质研究 摘 要 近年来食物过敏问题越来越受到人们的关注，每年由于过敏食物引起严重过敏反应的 人不在少数，甚至危及生命。国内外的研究表明，由蟹类食物引起的过敏发病率逐渐上升， 蟹类中含有两种重要过敏原：原肌球蛋白 (tropomyosin, TM)和精氨酸激酶(arginine kinase, AK) 。目前对于 TM 的研究较多，但大多集中在提取纯化及免疫学方面的研究；对于 AK 而言，则更多集中在酶学性质及分子克隆方面的研究。因此，加强对 AK 和 TM 的过敏原 性质研究显得十分重要。 本研究以拟穴青蟹为原料，首先对其 AK 和 TM 分别进行提取纯化，建立 AK 和 TM 的 ELISA 检测技术，并应用于水产品中 AK 和 TM 含量的检测。采用十二烷基硫酸钠-聚 丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)、免疫印迹 (western blotting) 及酶联免疫吸附测定（ELISA ） 等方法研究 AK 的理化性质及消化稳定性。其次，采用不同加工处理方法对蟹肉进行处理， 分析加工处理对蟹肉 TM 的消化稳定性及致敏性的影响。最后采用体外模拟胃肠液二相消 化实验比较 AK 和 TM 的消化稳定性，并对AK 和 TM 的三级结构进行预测。 采用硫酸铵盐析、柱层析等方法对 AK 进行提取纯化，首先对 AK 的温度、pH 稳定性 及消化稳定性作了相关研究，结果显示，AK 为热不稳定蛋白，在温度达到 46 ℃后，随着 温度的升高，AK 逐渐形成多聚体，进而凝聚形成沉淀，即发生了蛋白质变性作用。在强 酸性缓冲液(pH 1.0 ) 中孵育 1.5 h 后可以发现 AK 产生了部分降解。参照美国药典中模拟胃、 肠液消化实验方法，AK 经胃蛋白酶消化 1 h 后原始条带被完全降解，但 AK 并不容易被肠 液中的胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶降解，且肌浆蛋白中其他蛋白的存在会影响 AK 的模拟胃、 肠液消化特性。其次，以纯化所得 AK 建立了 ELISA 检测技术，并对八种不同水产品中 AK 含量进行了检测。结果显示，甲壳类动物如南美白对虾、斑节对虾和虾蛄中 AK 的相 对含量较高，而软体动物及双壳纲动物中 AK 含量则较低。 采用等电点沉淀、硫酸铵盐析等方法对 TM 进行提取纯化，并通过不同加工方法(蒸煮、 超声波结合蒸煮、高温高压、蟹肉罐头处理、烹饪处理等)处理蟹肉，参照美国药典中模拟 胃、肠液消化实验方法，对处理后蟹肉的TM 粗蛋白进行消化，分析其消化稳定性及消化 产物的致敏性。结果显示，不同加工处理方法对蟹肉中 TM 的消化稳定性均有一定影响， 其中高温高压处理能在较大程度上促进 TM 在模拟胃、肠液消化过程中的降解，TM 及其 消化产物的致敏性也有所降低。在蟹肉罐头加工处理过程中，植酸钠的添加能在一定程度 上促进 TM 的降解，使其更容易被胃液及肠液分解。另外，在蟹类食品烹饪过程中添加适 量的醋也能促进 TM 在模拟胃液中的消化分解。总结几种加工方法，高温高压处理在降低 I TM 过敏性方面最为显著。同样以纯化所得 TM 建立了 ELISA 检测技术，对水产品中 TM 含量进行了检测。结果表明，甲壳类动物如南美白对虾、斑节对虾和虾蛄中 TM 的相对含 量较高，而软体动物及双壳纲动物中 TM 含量则较低。 最后，对蟹肉粗提液进行了体外模拟胃肠液二相消化实验，并对 AK 和 TM 的三级结 构进行了预测分析。结果显示，在体外模拟胃肠液二相消化实验中，AK 比 TM 容易被胃 蛋白酶降解，而 TM 则对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的消化作用不耐受。此外，TM 的三级 结构比 AK 简单，主要为超螺旋结构，而 AK 则有复杂的空间结构，含有 α-螺旋、β-折叠 和 β-转角，AK 和 TM 三级结构的不同可能导致二者理化性质及消化稳定性方面的差异。 总的来说，本研究分析了蟹类 AK 的理化性质及消化稳定性，首次证实AK 为对热、 酸均不稳定的过敏原。重点对蟹类 TM 的加工特性进行了探索，发现高温高压、植酸钠结 合罐头处理、加醋烹饪的加工方法能够促进 TM 的消化降解及其致敏性的降低。采用体外 模拟胃肠液二相消化实验对 AK 和 TM 的稳定性进行了比较，明确TM 是更为稳定的过敏 原。这些结果可望为蟹类过敏原性质及脱敏方面的深