根肿病菌侵染茎芥差减文库的构建及其差异表达基因鉴定.pdf

Construction of Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Library of Brassica Juncea var. Tumida Infected by Plasmodiophora Brassicae and Identification of Differentially Expressed Genes A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Doctor’s Degree of Science By Luo Yuanli Supervised by Prof. Wang Zhongkang Major: Botany School of Life Science, Chongqing University, Chongqing, China April, 2014 中文摘要 摘 要 茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen ）, 是重庆市涪陵区的特色农业资源， 其收获物瘤茎（俗称青菜头）是世界三大名腌菜之一“涪陵榨菜” 的主要原料。茎瘤 芥营养丰富，加工后形成的榨菜脆嫩爽口、味道独特，深受国内外消费者的喜爱。 榨菜业的发展为涪陵地区带来了稳定的经济效益和社会效益。可近年来，由于十 字花科根肿病的扩展蔓延，严重影响茎瘤芥的产量，造成巨大的经济损失。根肿 病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae ）侵染所致。鉴于根肿病菌是一种单 科单属的活体专性寄生真菌，不能进行体外人工培养，病原菌全基因组未测序， 已知功能基因甚少，与其他病原菌的同源性不高，加之抗性材料缺乏，给抗病育 种带来较大的影响。培育抗病品种是防治根肿病最有效的途径，抗性品种的选育， 需要探明根肿病菌和茎瘤芥之间的分子互作关系，阐明根肿病的致病机理。 因此，本论文从芸苔根肿菌和宿主茎瘤芥之间的分子互作入手，发掘茎瘤芥 受根肿菌侵染后差异表达基因并研究其潜在的功能，将为阐明根肿病的致病机理、 获得抗病相关基因，为病害的防治奠定基础。本研究通过几年研究工作，取得了 以下主要成果。 1）成功构建茎瘤芥抑制差减杂交文库：基于建立的稳定重复利用的茎瘤芥苗 无土快繁种植体系，即采用珍珠岩加MS营养液，在光照培养箱中大量培育茎瘤芥 幼苗。茎瘤芥苗两周达到出四叶期，为芸苔根肿菌的致病性接种及病原菌和寄主 植物的互作提供了充足试验材料。利用抑制差减杂交文库技术，以人工接种感染 芸苔根肿菌的感病植株和健康植株分别作为实验组和驱动组成功构建抑制差减杂 交文库。经蓝白斑筛选，菌落PCR验证和斑点杂交，获得224个阳性克隆子。将阳 性克隆子测序，得到高质量的EST序列196条，平均长度为332bp 。将聚类、拼接的 173条EST序列和NCBI 的NT 、EST数据库进行比对，其中146条 (84.4%) EST序列 和植物已知序列具有同源性。将聚类、拼接的173条EST序列所编码的蛋白质与 NCBI 的NR数据库进行比对，其中58条EST序列（33.5% ）所编码的蛋白质和已知 蛋白基因具有相似性，15条EST序列（8.7% ）和假想蛋白基因具有相似性，100条 EST序列 （ 57.8% ）与已知蛋白的基因没有同源性。利用在线软件对编码的蛋白质 功能进行生物信息学分析显示，这些基因编码的蛋白质参与了多种细胞结构和分 子过程，如能量代谢(11.11%)、压力反应和防御(5.56%)、运输(5.56%)、转录调控 (5.56%)、翻译和生物合成（33.33% ）及其他功能(38.91%) 。EST序列在线提交NCBI