植原体免疫膜蛋Imp的原核表达及多克隆抗体制备.pdfVIP

摘要 植原体免疫主导膜蛋白(IⅡlp)是植原体免疫膜蛋白系统中重要的成员，在植原体 传播、致病的过程中可能起着关键的作用。对植原体膜蛋白组的研究，可探寻植原体 致病机理，：另通过免疫获得植原体各膜蛋白特异性抗体可制备高通量蛋白质检测芯 片。本实验开展了原核诱导表达hnp，亲和层析纯化目的蛋白以及Imp多克隆抗体制 各等一系列：工作。 I酶切位点的 本研究以重组克隆质粒pMDl8．T-f唧为模板，利用含A忱I、勋D 诱导、SDS．．PAGE电泳分析，重组菌BL2 白，与预期的携带6×His blotting检测 Tag的目的蛋白(19．5KD)大小相符。W毛stem His Tag，结果显示带有6×His№的Imp融合蛋白在大肠杆菌中能够成功表达。可 溶性分析显示，表达的Imp融合蛋白在大肠杆菌体系内以可溶蛋自和包涵体两种形式 存在，主要为包涵体蛋白。 重组菌BL21 0ET-28a(+)．j碑，)培养条件正交实验结果表明，最佳培养条件参数 7．0，装液量20％。重组菌培养8h达到稳定期。根据方差分析， 为：温度37℃，pH 一定的范围内，培养温度对重组菌生长影响最显著，各因素影响主次为：温度装液 量pH。诱导条件正交实验结果表明，最佳诱导条件组合为：温度37℃，起始OD600 ≈1．5，IPTG终浓度O．1nun01／L，诱导培养6h。根据方差分析，诱导温度与诱导起始 0D600值对hnp的表达量影响最显著，各因素影响主次为：诱导温度诱导起始OD600 值诱导时间IPTG终浓度。实验结果显示诱导物IPTG与目的蛋白表达对重组菌的 生长产生影响，菌体的生长量与融合蛋白的表达量呈线性相关。以优化条件发酵重组 菌，融合蛋白hnp的表达量约为70m∥L。 His—Bind树脂 Tag，Ni·NTA 原核表达载体pET-28a(+)表达的融合蛋白带有6×His 作为亲和材料纯化融合蛋白Imp。200ml发酵菌体裂解液与1ml的树脂结合，使用8m1 含40r州咪唑的洗涤缓冲液可除去绝大部分杂蛋白，4ml含300mM咪唑的洗脱缓冲液 可基本洗脱目的蛋白。研究表明以包涵体为材料，变性条件下纯化获得较高浓度与纯 度的Imp蛋白。纯化的可溶性蛋白透析脱咪唑，浓缩获得0．8mg／mlImp蛋白溶液，纯 度95％。将纯化的融合蛋白免疫家兔后，成功获得了兔抗Imp多克隆抗体。间接ELIsA 特异性反应。 关键词：植原体，免疫膜蛋白，原核表达，亲和层析，多克隆抗体 Abstract Immunodominant membrane oneofthemost member P11ytoplaSma protein(Imp)is important of t}leimmllnodominantmembrane a roleiIl也e a11d proteins(IDPs)system，tIlatmaypIay key spread of of membrane patho寥IlicprocessphytoplaSma．studiesph”oplasma proteingroupcouldexplore也e mechanismof in detectioncaJlbemade pathog咖c phyto