有丝分裂激酶PKTOPK结构和功能的研究.pdfVIP

摘要 摘要 ff-LAK PDZ-bmdmg-kirtlecell-ofiginatcdproteinkin州PBI(dTOPIO是近年 来新发现的一种Ser：／Thr激酶，在很多肿瘤细胞中高表达，与这些肿瘤细胞的快 速增殖密切相关，并在细胞的恶性转化中起作用。PBIGffOPK在细胞有丝分裂 期也高表达，被磷酸化激活并参与细胞周期调控。但是有关PBKdTOPK的活性 调控机理及其在癌细胞恶性转化中的具体作用机制目前都不十分清楚。 本文通过构建表达质粒，利用原核表达系统大量表达PBKfrOPK及其突变 体蛋白，经亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析分离纯化出较纯净的重组 蛋白，应用晶体筛选试剂盒在4℃和20℃分别筛选蛋白质晶体。初筛的晶体经 过优化，通过X射线衍射收集数据，表达纯化硒代甲硫氨酸蛋白并结晶用于确 定相位、解析晶体结构，获得了PBK／TOPK的结构信息。应用FPLC分析了不 同pH条件下溶液中PBK／TOPK的构象情况，发现野生型蛋白不发生聚集，但 10．5的情况下可以发生聚集。通过荧光光谱法和等温滴定量热 突变体蛋白在pH 过变性复性法纯化组蛋白H3，成功建立起了以组蛋白H3为底物的激酶活性研 究体系，用来检测PBICrrOPK的激酶活性。培养293T细胞，通过瞬时转染在 293T细胞内表达PBK／TOPK，免疫沉淀获得表达的蛋白并用于激酶活性检测。 最后，利用昆虫表达系统表达纯化出了具有激酶活性的蛋白，为进一步阐明 PBKJTOPK在有丝分裂和细胞增殖中的作用机理提供依据。 关键词：PB列ToPK；蛋白纯化；X光衍射与结构解析；组蛋白磷酸化 Abstract Abstract a PBK／TOPK(PDZ-bindingkinase／T-LAK-cell-ori西natedproteinkinase)is kinasethatis in tumorsands∞nlsto novelserine／threonine highlyexpressedmany of a rolein ormetastasis．ThelevelPBK／TOPKis playkey tumorigenesis expression increasedmitosisand inacell manner．The cycle—dependent during phosphorylated forits ofPBK／TOPKis activationand phosphorylation required function．However, the roleand mechanism theeffectsofPBK／TOPKin precise regulatory explaining tumorcellsstillremainselusive． clonedand therecombinantPBK／TOPKinE．coli．Protein Here，we expressed was filtration andion purifiedthroughaffinitychromatography,gelchromatography