水稻纹枯病菌三酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建.pdfVIP

水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗 传转化体系的构建 摘要 由立枯丝核菌(肋比Dc幻聆妇勋缸，lf)引起的水稻纹枯病是世界性 的水稻三大病害之一，几乎所有的稻田都会发生纹枯病，全世界平均 每年因该病造成的损失稻谷达数十亿公斤。因此，对水稻纹枯病菌的 研究具有非常重要的科学和实际意义。由于缺乏有效的遗传转化系 统，对该病的研究主要集中在病菌的分类、抗性机制、病害流行与防 治等研究。 关于水稻纹枯病菌的遗传转化，国外己有了一些报道，国内则报 道甚少。对于立枯丝核菌的转化效率，相关报道显示也是比较低，采 用合适的启动子，是能否进行高效转化的关键因素之一，因此寻找水 稻纹枯病菌高效启动子是提高其转化效率的一种途径。甘油醛．3．磷 酸脱氢酶(Glyceraldehyde3一phosphate 胞中高效表达，如在酿酒酵母(勋cc^口厂D，砂c钌ce例括f口P)其含量可 达细胞内可溶蛋白的5％；在面包酵母中其mRNA的量占总ln]fⅢA 量的2—5％。因此，G尸!D基因的启动子可能为一强启动子。而且在许 多不同的真菌中，a移基因启动子已经被成功地用来构建转化体系。 本研究利用同源克隆及染色体步移策略，从水稻纹枯病菌基因组 l 列，分析显示其拥有lo个内含子。southem杂交结果显示，思卯D ‘t 在水稻纹枯病菌基因组中以单拷贝形式存在。＆卯D编码343个氨基 酸的蛋白。蛋白序列同源性分析，鼬∞D基因氨基酸同源性与立枯丝 ～ 核菌国际标准融合群AG．3最高，达85．52％。此外，在不同融合群的 立枯丝核菌中内含子的分布及大小具有高度相似性。 根据廷GPD基因设计引物，扩增水稻纹枯病菌的GPD启动子。 ＼ 歹0含有T芦江A．box、CAA]r-box、G．box、SPl．box及CTrich．motif等JI顷 式作用元件。采用PlaIltCARE数据库及TFSitescansen，ice软件分析 G肋启动子片段，结果表明，该片段含有多个转录因子如ADRl、 动子启动潮霉素抗性基因的表达载体，其中2个载体的潮霉素基因做 了如下改进，通过Over-lap 间的AT转变为GC或在潮霉素基因两端添加水稻纹枯病菌的漆酶 (z54277)内含子。利用上述质粒，进行农杆菌介导转化水稻纹枯病 菌菌丝体及菌丝球。最终在农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝球中， 获得了转化子。然而这些转化子在继代培养中，潮霉素抗性性状，出 现了丢失的现象。表型分析表明，这些转化子为非整合转化(Tfansient 因而在生长或继代的过程中丢失。此外，转化子获得数量偏低，表明 该遗传转化体系有待进一步优化。 n 关键词：立枯丝核菌，甘油醛．3．磷酸脱氢酶基因(a仞)，G尸D 启动子，农杆菌介导转化 CLONINGOF DEHYDRoGE]NASEGEN但AND OF AGROBACTERn7M．MED¨汀ED SYSTEMOFR日啪C刀p7V=纠＆[圮么M ABSTRACT cesheath iscaused is blight，which by尺Jll比Dc幻n砌sD肠，lf in me consider．edtobethemostdestructivediseasericeallove：r world． the and this haVe Stlldiesof 0f