海栖热袍菌来源半纤维素酶系协同降解反应的研究.pdfVIP

摘要 摘要 随着社会经济的快速发展，石油危机及当今世界对能源需求的急剧增加，加 快了人们开发可再生清洁能源的步伐，在自然界中，半纤维是仅次于纤维素的生 物质资源，它与纤维素和木质素交联在一起，要实现对其彻底降解，需要多种酶 类协同作用，本文将关注点集中到一类半纤维素一木葡聚糖，已往的研究对其在 生物质降解中的重要性缺乏足够的重视，本文着重对木葡聚糖降解的关键酶a． 木糖苷酶进行超量表达及酶学性质分析，并对木葡聚糖进行体外酶联降解，另外， 用重组高效表达的耐热木聚糖酶系分别降解提纯的桦树、甘蔗渣、玉米芯和蓝莓 渣木聚糖，并对降解产物进行定性及定量分析。 maritima MSB)基因组，推测其中 1．通过研究海栖热袍菌(Thermotoga 含有一个与降解木葡聚糖有关联的基因簇，以基因簇中的Q-木糖苷酶XylG为研 究对象，将其克隆到高效热激表达载体pHsh上，得到pHsh．xylG，通过基因定 点突变的方式实现了其在大肠杆菌中的高效表达，首先对重组质粒TIR区的 mRNA二级结构在线分析使RBS及ATG从发卡结构的互补配对区中释放出来， 其次，将基因N端翻译起始区的一段较集中的稀有密码子作修改，得到了突变 质粒pHsh．xylGII和pHsh．xylGm，并将它们分别转入大肠杆菌DHl0B中热激诱 导表达，优化后的重组质粒表达量提高了15倍。SDS．PAGE密度扫描结果显示 最终重组酶的表达量占到总可溶性蛋白表达量的40％，表明其N端稀有密码子 严重影响基因的高效表达。 Fast 通过热处理，DEAE Flow阴离子交换层析等步骤对重组酶进 Sepharose 行提纯，纯化后的酶在SDS．PAGE胶上为单一电泳条带，分子量88kDa，所得 纯酶的比酶活为55．7U／mg，酶的纯化倍数为12．5倍，得率是86．7％。纯化结果 显示，用热处理去除宿主蛋白，目的蛋白达到电泳纯，回收率达到80％，这一 结果表明在今后的工业化应用中可以用热处理这种低成本而简便的方式制备该 酶。 另外，我们对纯化后的重组酶进行酶学性质分析，重组酶对底物pNPS的活 5．0．7．5范围内，酶活性均能维 性测定结果表明，该酶的最适pH为5．0，且在pH 持在60％以上。最适温度为85℃，重组酶热稳定性为85℃保温1h酶活保持在 80％，热稳定性非常好。金属离子和抑制剂等对酶活影响的研究发现：C02十、Ni2十、 Lil+、EDTA对酶的活性没有显著影响；Zn2十、Cu2、Fe2+对酶活均有显著的抑 按Eadie．Hofstee作图法作图分析该重组酶对pNPS底物的动力学参数。根据线性 摘要 回归方程计算Km为0．04 mmol，Vm。为78 U／mg。 2．将基因簇中的p半乳糖苷酶基因galC和Q．岩藻糖苷酶基因afiaD克隆到 实现了超量表达。结合本实验室以研究的海栖热袍菌来源的纤维素酶CelB、内切 葡聚糖酶Cel74、p葡萄糖苷酶BglA和叶阿拉伯糖苷酶心aB，用这几种酶联合降 解木葡聚糖(罗望子)TLC分析结果显示，XylG对木葡聚糖的降解至关重要。 Cel74降解木葡聚糖比CelB特异性更高。而GalC和AraB也有促进降解作用。 3．利用本实验室已构建的木聚糖降解酶系，包括内切木聚糖酶XynB，p． 木糖苷酶XylC，a-5可拉伯糖苷酶AraB。我们又构建了海栖热袍菌来源的葡萄糖 醛酸酶重组质粒pHsh．aguA，并在大肠杆菌中超量表达。用这些酶协同降解从桦 树、甘蔗渣，玉米芯和蓝莓渣提取的天然木聚糖，TLC分析结果显示，针对不同 植物来源的木聚糖需要选择相应的木聚糖酶系去联合降解，通过合理的酶联反 应，多酶联用可有效将玉米芯和蓝莓渣来源的木聚糖降解为单糖，在对甘蔗渣的 降解反应中，我们发现有两条寡糖链是上述酶无法降解的，通过颜色判断有可能 是葡萄糖组成的