深海微生物来源KSNRPS合成基因(簇)的筛选及其初步功能分析.pdfVIP

摘要 摘要 深海环境是一个具有高压、低温(部分区域如热液口为高温)、厌氧、极端 pH等特点的极端环境，然而它却占地球表面积的49％，被认为是目前地球上物 种资源最丰富的地区。由于其生态环境的特殊性，决定了深海微生物具有一些特 异的代谢途径和遗传背景，导致深海微生物次生代谢产物具有化学结构奇特、新 颖，生物活性多样等特点。特殊结构天然产物，对发现药物先导化合物、研究药 物作用新靶点、新机理等具有重要科学意义。 在这些具有药效作用的天然化合物中，聚酮化合物(PKs)和非核糖体多肽 化合物(NI冲s)占了很大一部分，我们的研究也是针对这两类化合物的。 目前，对PKS、NRPS的研究表明虽然聚酮化合物(PKs)和非核糖体多肽 化合物(NRPs)结构千差万别，但其生物合成过程却极具规律性，而且PKS、NRPS 这两种酶的氨基酸序列具有一定的保守性。这为聚酮类化合物和非核糖体肽合酶 的基因筛选提供了基础。 本文从可培养和不可培养两种途径对深海环境微生物来源的PKS／NRPS合 成基因簇进行筛选及其功能活性分析。可培养途径是通过深海沉积物样品分离获 得的深海真菌，对其进行含PKS／NRPS基因簇的筛选，然后对筛选到的菌株进 行活性检测，最后对其中细胞毒活性良好的菌株进行次生代谢产物的分离鉴定； 不可培养则是通过对用深海沉积物构建的宏基因组fosmid文库，使用PCR方法 进行含PKS，NRPS基因簇的克隆子筛选，并对筛选到的克隆子做测序分析和发 酵产物活性分析等，期望为未来先导化合物分离及组合生物合成提供新的生物元 件。 经过两轮PCR筛选后，在6个文库中筛选到一个含PKS／NRPS基因簇阳性 克隆子，该基因簇序列初步推测为新的基因簇，但在克隆子里未得到表达，因而 无抗菌活性和细胞毒活性；在可培养的深海真菌中发现多株含有PKS／NRPS基 因簇的真菌，它们有不同程度的抗茶叶病菌活性及细胞毒活性，选取了7．1和38 号菌株进行次级代谢物的化合物分离与鉴定，最后分离到并分析出了两个生物碱 摘要 类的化合物的结构，然而它们有何特性以及与PKS／NRPS基因簇有何关联还有 待进一步研究。 实验结果表明要从宏基凶组文库中筛选到一个含完整的PKS／NRPS基因组 且能表达产生活性物质的克隆子，还有难度，效率还较低，技术不够成熟，宏基 因组文库的PKS／NRPS基因簇筛选还有待进一步研究；但深海来源的真菌是可 行的，它有助于提高药物筛选的效率。 研究结果为深海微生物活性产物的筛选及应用提供了基础数据。 关键词：PKS：NRPS；PCR U Abstract environmentis a Deep。sea areasis high—pressure，lowtemperature(some suchas high-temperaturehydrothermal andother vents)，anaerobic，extreme pH characteristicsof extreme itaccountsfor49％of environments,yet Earth’S surface，is considered弱therichest onearth species ofits