猪诱导多能性干胞系建立及改善其多能性研究.pdfVIP

摘要…………………………………………………………………………………………．．I 英文摘要…………………………………………………………………………………………………Ⅲ 1弓l言……………………………………………………………………………………………………………………-l 1．1胚胎干细胞的建立………………………………………………………………………1 1．2猪胚胎干细胞的研究进展……………………………………………………………·2 1．3诱导多能性干细胞的建立……………………………………………………………·2 1．4猪诱导多能性干细胞的建立…………………………………………………………一4 1．5本研究的目的和意义…………………………………………………………………………………一7 2材料与方法………………………………………………………………………………“8 2．1实验材料……………………………………………………………………………………8 2．1．1实验动物和材料……一……………………………………………：．．………………”8 2．1．2主要仪器与设备………………………………………………………………………8 2．1．3主要试剂及试剂盒…………………………………………………………………9 2．1．4常用试剂及配制………………………………………………………………………………-10 2．2实验方法……………………………………………………………………………··13 2．2．1细胞培养………………………………………………………………………………13 2．2．2病毒包装…………………………………………………………………………15 2．2．3 iPS细胞的诱导……………………………………………………………………16 2．2．4多能性细胞的鉴定………………………………………………………………·17 2．2．5猪体细胞核移植的主要步骤………………………………………………………20 2．2．6孤雌和体外受精胚胎体外培养…………………………………………………··2l 2．2．7其它实验方法……………………………………………………………………．21 3结果与分析……………一…………………………………………………………………………”23 3．1Nr5a2和TbX3在猪诱导多能性干细胞中的重要作用………………·………………一23 3．1．1 3．1．2猪iPSCs多能性的鉴定………………………………………………………………24 3．2 消化后的活力……………………………………………………………………………28 3．2．1通过添加Y27632能够改善4F piPSCs的单细胞消化后的活力…………………·28 3．2．24F 3．2．3 Nr5a2和Tbx3能够改善4F piPSCs的单细胞消化后的活力………………………31 3．3减少转录因子诱导猪iPSCs…………………………………………………………··32 3．3．1两个或单个转录因子结合诱导猪iPSCs…………………………………………·32 3．3．2减因子获得的猪iPSCs的多能性鉴定……………………………………………34 东北农业大学理学博士学位论文 3．3．3减因子获得的猪iPSCs对外源基因的依赖性………………………………………34 3．4同一猪成纤维细胞的iPSCs诱导效率和核移植效率具有正相关性…………………··35 3．4．1不同胎儿来源的成纤维细胞的iPSCs诱导效率不一样…………………………··35 3．4．2获得的猪iPSCs的特性…………………………………………………………………·36 3．4．3猪iPSCs的多能性鉴定………………………………………………………………··37 3．4．4不同个体来源的PEF的核移植效率不一样，并且与piPSCs的诱导效率 呈正相关………………………………………………………………………………………………·38 3．4．5猪种内不同的piPSCs的核移植效率趋于一致……………………………………39 3．4．6 piPSCs的核移植胚胎中