油藏环境中烷烃加氧酶基因定性、定量以及转录水平分析.pdfVIP

摘要 摘要 传统的纯培养方法在分析微生物群落方面有很大的局限性，主要表现在分 析时间长、精确度不高、覆盖范围过窄、操作过程复杂等方面。为了克服这些 限制，我们引入分子生态学方法(PcR-DGGE分析和实时荧光定量PCR分析) 进行油藏烷烃降解菌群落的定性和定量分析。 通过对烷烃单加氧酶的相关保守区域设计引物，以嗜热脂肪地芽孢杆菌 DM．2作为标准菌株进行PCR．DGGE的条件优化和可行性分析，在此基础上， 建立了针对油藏环境中烷烃单加氧酶基因多样性及其变化分析的PCR-DGGE方 法体系。利用该方法，对新疆六中区四口采油井在生产过程中的烷烃单加氧酶 基因多样性及其变化进行跟踪分析，发现其中两口采油井的烷烃降解菌有明显 激活现象，烷烃单加氧酶基因类型的多样性明显降低，某一种或者几种类型烷 烃单加氧酶基因数量占据优势；而烷烃降解菌未激活的两口采油井中烷烃单加 氧酶基因的类型没有明显的改变，各种类型的烷烃单加氧酶基因差异较小。 利用嗜热脂肪地芽孢杆菌DM．2为标准菌株，建立了基于实时荧光定量PCR 对烷烃单加氧酶基因进行定量的分析体系，确定了分析的最佳引物和最优条件。 在此基础上，对新疆六中区四口油井在采油过程中烷烃单加氧酶基因变化进行 定量分析，并与传统的MPN培养法进行对比，确定实时荧光的定量分析的可信 度。连续的检测数据显示，其中两口井的烷烃单加氧酶基因数量明显地增加， 从lO增加到104，表明其油井周围的烷烃降解菌被激活；而另外两口井的烷烃 单加氧酶基因数量并没有明显的改变(一直在101左右)，说明该油井的烷烃降 解菌未被明显激活，激活结果与烷烃单加氧酶基因多样性的定性分析结果一致。 为了研究油藏环境中不同时期单加氧酶的表达情况，利用实验室模拟激活 样品和现场样品进行烷烃单加氧酶基因的转录分析，结果表明不同链长的烷烃 能导致不同烷烃单加氧酶基因的差异表达：当正十四烷存在条件下，各基因表 达量只略有上升；在正二十六烷存在条件下，各基因的表达量显著增加，而在 正十八烷、正二十二烷或正二十八烷存在条件下，个别基因(口船1和alkB2) 的表达量有明显的优势。 关键词：烷烃单加氧酶；PCR．DGGE；实时荧光定量PCR；微生物群落结构 Abstract Abstract Ithas limitationsin the microbial great analyzingcomplex communityby traditionalculture it aslow technology；and mainlypresentedefficiency,low and andSOOil．Inorderto proportionmicroorganismscomplicated operation oveIcomethose introducemolecular methods limitations，we ecological (PCR—DGGEandReal—timePCR themicrobial analysis analysis)toanalysis ofalkane inreservoirenvironment． communitydegraders Wehave the basedonthe developedhighlydegenerateprimersdesigned alkane conservedofalkane for