泡沫病毒与人类疫缺陷病毒反式激活因子乙酰化的初步研究.pdf

摘要 摘要 乙酰化是除磷酸化之外另一种重要的蛋白翻译后修饰形式，底物蛋白的可逆 两种酶可调控许多种类蛋白的乙酰化修饰，包括组蛋白、转录因子、细胞骨架 和信号通路蛋白等。而且，这些HATs介导的乙酰化具有多种功能来控制细胞内 的调控途径，如细胞周期调控、DNA修复、核运输和微管形成。近年来，关于 病毒(尤其是慢病毒与DNA肿瘤病毒)利用细胞内乙酰化途径调控特异的宿主 和／或病毒基因，进而激活病毒启动子完成病毒复制的报道逐渐增多。人类免疫 的反式激活因子Tat、仫和仇可被不同眦乙酰化，并促进了它们的反式激 活功能。因此，病毒蛋白的乙酰化在其复制和生活周期中具有关键作用。 泡沫病毒(FV)是一种特殊而复杂的反转录病毒，属反转录病毒科中的泡 沫病毒亚科。FV具有广泛的宿主范围，从猫、牛、马到灵长类动物均可感染。 然而，至今在体内尚无FV感染与疾病有紧密联系的证据。FV在，鲫基因和P1， 基因的3’端之间具有第二个启动子，称为内部启动子(IP)，这一特性使得FV 与其它仅有LTR启动子的反转录病毒有着明显的区别。 PFV的协蛋白是其反式激活因子，在病毒转录激活中具有核心地位，研究 发现其具有乙酰化修饰现象，且乙酰化增强协结合LTR的水平，进而促进转 录起始。牛泡沫病毒BFV于1983年从牛体内首次分离到，对BFV基因组进行 遗传学分析表明，这一非灵长类FV与PFV之间具有相似的基因组结构。B亿 蛋白含有249个氨基酸，可结合L1R和IP并激活转录。在BFV生活周期中， 其反式激活因子B协蛋白可能起到中心调控因子和潜伏一裂解感染转换开关的 作用，但其详细机制有待深入探讨。因此，PFV协的乙酰化现象，在BFv中 是否同样存在，乙酰化B协的HAB有哪几个，以及乙酰化功能和调控机制与 协的异同又如何，这些问题的阐明有利于从另一角度对泡沫病毒复制调控的机 制进行比较与研究。 在本文中，我们对于B‰的乙酰化修饰和乙酰化后的功能进行研究。通过 免疫沉淀实验，我们发现在体内p300可特异性乙酰化B仇。随后，为研究B协 是否在体外也是乙酰化的，我们构建了体外乙酰化系统，此系统可高效地乙酰 摘要 HAT区蛋白能在体外乙酰 化组蛋白H3。随后通过此体外实验，我们发现p300 化B协。位于第66、109和1lO位的赖氨酸是p300乙酰化B协的底物氨基酸。 与野生型相比，B协乙酰化突变体的亚细胞定位没有差异。然而，乙酰化赖氨 酸突变致使B亿不能激活LTR和IP启动子。随后本文对DNA结合能力是否受 B‰乙酰化影响进行分析，发现p300的乙酰化增强了BT弱的DNA结合能力。 有趣的是，B1瓠的乙酰化突变体(K66／109／110R)不能结合于BFVLTR的DNA 应答元件。进一步凝胶阻滞实验的结果显示，Kll0对BT鹤结合DNA是必须的， 而B佻DNA结合水平的提升应主要源于K66和K109的乙酰化。上述结果表明 乙酰化赖氨酸对BT弱的反式激活功能是十分重要的，而且p300介导的BT弱乙 酰化应参与了BFV的转录起始与病毒复制。 先前报道表明PFV协蛋白与PCAF和p300有相互作用，前者还使协发 生乙酰化。因此，本文分析了其它两种HAITs，即CBP和GCN5对佻转录激活 的影响。在萤火虫荧光素酶实验中，我们发现1瓠与CBP／GCN5可协同激活PFV LTR。另一方面，GCN5激活PFVIP也呈现出剂量依赖效应，但CBP对协激 活Ⅲ影响不大。随后，通过将亿与各种HA瓜共转染并进行免疫沉淀实验， 鉴定到p300也可乙酰化协，但其乙酰化水平比PCAF要低。这些结果暗示亿 可能被不同的HAn乙酰化，进而有利于其行使反式激活功能。总体而言，p300 对两种反式激活因子的功能均有促进作用。从乙酰化修饰来说，PFV协和BFV B协均可被p300乙酰化，但在后者中，p300是B协的主要乙酰化酶，而p300 虽可乙酰化协，其乙酰化程度低于PCAF对协的乙酰化水平，体现出这两种 FV对HA弧的偏好性是不同的。 HIV．1的反式激活因子Tat同样存在乙酰化修饰，多种HAn可以Tat为底物， 乙酰化不同的赖氨酸，并使Tat产生不同的功能变化，目前对其乙酰化调控机制 已了解得较为清楚。对于Tat乙酰化功能的研究，多是基于参考株Tat开展的。 与Env相比，虽然Tat的