男性不育相关蛋MLH1和miR-383在精子发生中的功能研究.pdf

摘 要 摘 要 男性不育是一个世界范围性的生殖健康问题。更重要的是，近年来研究表明 男性不育患者有易发睾丸癌的风险。然而，大部分非梗阻性无精症（NOA ）患 者的病因不明（特发性不育），且临床治疗有限。一些研究表明减数分裂同源染 色体重组缺陷以及生殖细胞增殖凋亡失衡可能是成熟抑制型NOA 患者的潜在致 病因素。因此，本文的目的是鉴定参与这些病理缺陷发生的调控因子及其途径， 并分析是否这一调控因子/途径介导了不育患者的睾丸癌易感性。 首先，需要了解正常情况下男性同源重组的调控模式。重组过程涉及同源配 对染色体间的交换位点（crossovers，COs，由粗线期MLH1蛋白标记）形成。在 人类中，COs 的分布受正干涉调控，即一个COs 的形成会抑制其它COs在它邻近 形成，从而使COs沿染色体分散排布。分析结果表明交换干涉可连续通过着丝粒 起作用，且交换干涉水平在个体间、染色体间和染色体内均存在显著的变异，即 小号染色体的干涉水平强于大号染色体，而臂间干涉强于臂内干涉。此外，SCs 对交换干涉水平大小具有重要的调控作用，这主要表现在两方面：1）交换干涉 存在染色体间效应，而这种效应与SCs的长度相关，即两长度类似的SCs上交换 干涉水平更易发生相互关系；2 ）染色体结构异常可影响干涉水平，如9号染色体 上出现的不连续区域gaps及未联会区域splits可cis/trans影响其本身和其它染色体 上干涉水平。本文首次表明交换干涉水平在全基因组范围内存在显著的异质性， 且至少在男性中，染色体联会异常可导致交换干涉水平的改变。 其次是鉴定成熟抑制型 NOA 患者中病理缺陷发生的信号调控途径。 microRNAs (miRNAs) 是一类小分子非编码 RNA ，已有研究报道其在精子发生 和肿瘤发生均扮演重要角色。为确定候选的功能性 miRNAs ，本文首先通过 microarray 技术筛选正常与不育患者中差异表达的 miRNAs ，发现 154 种显著下 调及 19 种显著上调的 miRNAs 。从中选取下调比较显著的miR-383 为研究对象， 原位杂交结果显示miR-383 主要表达于人精原细胞及初级精母细胞。经real-time PCR 分析证实其在精子发生停滞的不育患者中出现显著下调，而这种下调受到 转录及转录后水平调控，且与不育患者中生殖细胞过度增殖有关。在睾丸癌细 胞系 NTera-2 cells 中沉默内源的miR-383 也促进癌细胞增殖及细胞周期 G1/S 期转变，同时抑制本底凋亡，而过表达 miR-383 则出现相反效应。 进一步实验表明 miR-383 通过影响 mRNA 稳定性靶向转录因子 interferon regulatory factor-1 (IRF1) ，且miR-383 与 IRF1 在体内存在负相关关系，同时 miR-383 可抑制 IRF1 的细胞周期相关靶基因cyclin D1 、CDK2 及p21 表达。沉 默内源 IRF1 或 cyclin D1，而非 CDK2 增强 miR-383 介导的抑增殖效应。沉默 I 摘 要 p21 则对 miR-383 介导的抑增殖效应起负反馈调控作用。此外，miR-383 可通过 提高 CDK4 的蛋白酶体降解抑制其表达，最终导致G1 期关键调控因子 pRb 磷 酸化水平降低。这些研究结果表明 miR-383-IRF1-pRb 途径异常与不育患者中的 精原细胞增殖失调相关，且可能参与介导不育患者的睾丸癌易感性。 综上所述，本文描绘了正常情况下调控重组交换位点MLH1 的干涉模式以及 miR-383在生殖细胞增殖方面所扮演的角色，这些结果为进一步探讨NOA 患者中 同源重组缺陷以及增殖凋亡失衡的原因奠定了基础。 关键词：男性不育 MLH1 同源重组 交换干涉 miR-383 生殖细胞增殖凋亡 睾丸癌 II Abstract