砀山酥梨果实PO酶学特性、PPO克隆及生物信息学分析.pdfVIP

摘 要 砀山酥梨（Pyrus bretschneideri cv.）是我国栽培面积最大和对外出口的主要梨 品种。近几年，由于自然环境、品种退化、田间管理粗放等原因，梨果实石细胞含 量增多，导致果实肉质变粗，口感多渣，严重影响了砀山酥梨果实的食用品质和经 济价值。果实中石细胞是一种厚壁组织细胞，由次生壁在初生壁上沉积而形成，与 木质素的合成、转运及沉积密切相关。因此，对砀山酥梨果实中，石细胞发育、木 质素合成及影响因素的研究就具有重要的意义。木质素合成重要酶­多酚氧化酶 （PPO）可以通过木质素单体聚合等多种途径影响木质素的合成。 本实验以砀山酥梨果实为材料，研究了木质素合成重要酶 PPO变化规律，并探 讨 PPO 酶学特性，明确梨果实生长发育过程中，PPO 活性与木质素、石细胞含量 之间的关系。同时，克隆PPO cDNA，并进行生物信息学分析和结构预测，为从生 理生化和分子生物学水平了解石细胞发育机理，调节石细胞含量奠定基础。主要研 究结果如下：  1、砀山酥梨果实发育过程中，PPO 活性在花后 27 天和 47 天出现高峰，早于 木质素含量高峰(花后 47 天、61 天)和石细胞含量高峰(花后 51 天)。PPO 活性变化 与石细胞、 木质素含量变化趋势基本相同， 均表现为先升高后下降的趋势。 作为 PPO  的一类酶，漆酶在果实发育发育初期含量最高，之后迅速下降，花后 39 天短暂回 升后又迅速降低并维持较低水平。相关性分析表明，PPO活性变化与石细胞、木质 素含量极显著相关，但未发现漆酶活性与石细胞、木质素含量间有显著的相关性。  2、砀山酥梨果实 PPO 的最适温度为 40℃左右，且高温对 PPO 活性抑制作用 比低温更明显；不同 pH 条件下，PPO 活性变化表现为双峰曲线，高峰期分别出现 ­1  在 pH7.0和 pH5.0，且 pH7.0 条件下 PPO 活性为 513.86U∙g  ，显著高于 pH5.0 条件 ­1  下 PPO 活性 229.43U∙g  。以邻苯二酚为底物，梨果实 PPO  反应最适底物浓度是  ­1  ­1  0.16mol∙L  ； 酶促褐变反应动力学符合米氏方程， 动力学参数 Vmax 为 54.5455 U∙g  ，  ­1  Km 为 0.1364mol∙L  。  3、蔗糖、山梨醇、EDTA、柠檬酸、抗坏血酸对 PPO 活性均有一定的抑制作 用，同浓度情况下抑制效果为：抗坏血酸＞柠檬酸＞EDTA＞山梨醇＞蔗糖。当抑 ­1  制剂浓度为 0.02 mol∙L  时，柠檬酸、抗坏血酸对 PPO抑制作用最大，PPO相对活 ­1  力分别为 11.22%和 5.24%，浓度高于 0.5 mol∙L  时，无未检测到 PPO 活性。当抑 ­1  ­1  制剂浓度从 0.02mol∙L  提高到 0.5 mol∙L  时，EDTA对 PPO抑制作用最明显，PPO  残留活性下降了 71.45%。低浓度的蔗糖和山梨醇对 PPO 活性抑制作用不大，当浓 ­1  度达到 1.0 mol∙L  时，PPO残留活性分别为 41.60%和 31.20%。 I  4、利用 RT­PCR 技术克隆得到砀山酥梨果实 PPO  cDNA 保守片段 558bp，该 序列已登录 GenBank， 登陆号为 HQ329065。 利用 RACE 反应得到 3’片段和 5’片段， 分别为 1326bp和 689bp，拼接得到PPO cDNA 全长为 1992bp，开放读码框 ORF含 有 1782个碱基，编码 583个氨基酸，Genbank 登录号为 JF80985