秀丽线虫胰岛素号通路突变体的定量蛋白质组学研究.pdf

目录 摘要……………………………………………………………………………．I Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．III 第一章：引言…………………………………………………………………．．1 1．1衰老研究的背景………………………………………………………1 1．1．1衰老研究的进化学假说时代……………………………………1 1．1．2衰老研究的遗传学分析时代……………………………………4 1．1．3衰老研究的系统生物学时代…………………………………．儿 1．2定量蛋白质组学介绍及研究进展…………………………………．．16 1．2．1蛋白质组学的工作流程………………………………………17 1．2．2多肽的鉴定…………………………………………………．．17 1．2．3在蛋白质组学水平进行定量研究……………………………．19 1．2．4进行定量蛋白质组学实验时需要考虑的几点关键因素………21 1．3本研究的目的与意义………………………………………………．22 第二章实验材料与方法………………………………………………………24 2．1细菌菌株……………………………………………………………24 2．2线虫品系……………………………………………………………24 2．3线虫培养……………………………………………………………24 2．3．1线虫培养基所需试剂…………………………………………24 2．3．2线虫生长培养基的配制方法…………………………………．25 2．3．3 HG琼脂培养基………………………………………………．25 2。3．4 M9溶液的配制………………………………………………26 2．3．5 LB培养基的配制……………………………………………．．26 2．3．6线虫培养方法…………………………………………………26 2．4线虫的同步化培养…………………………………………………．27 2．5N一15标记线虫的培养方法…………………………………………28 2．6线虫基因组DNA的提取…………………………………………。．30 2．6．1单条线虫基因组DNA提取…………………………………．．30 2．6．2酚氯仿抽提法大量纯化线虫基因组DNA……………………．30 2．7线虫总RNA提取以及cDNA合成…………………………………32 2．7。1试剂及材料…………………………………………………．．32 2．7。2线虫总RNA提取……………………………………………．32 2．7．4第一链cDNA合成…………………………………………．．34 PCR………………………………………………．35 2．8定量real—time 2．9 RNAi实验………………………………………………．．36 Feeding 2．9．1实验试剂及材料………………………………………………36 2．9．2实验方法……………………………………………………．。37 2．10线虫寿命的测定…………………………………………………．．37 2．11使用FASP方法制备线虫蛋白质组样品…………………………．38 2．11．1试剂及材料…………………………………………………．38 2．11．2实验步骤……………………………………………………40 2．12色谱柱制备………………………………………………………．．42 2．12．1试剂、材料及仪器…………………………………………．42 2．12．2离线分离柱…………………………………………………．43 2．12．3预柱…………………………………………………………44 2．12．4分析柱………………………………………………………44 2．13样品的离线分离…………………………………………………．．45 2．13。1试剂与材料…………………………………………………．45 2。13．2实验方法……………………