稳定表达不同动犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立.pdfVIP

摘要 摘 要 犬瘟热(Canine distemper, CD) 是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV ）病 毒引起的一种高度接触性传染病。该病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的传染病 病之一，可引起大批犬、貂、狐等动物发病，发病死亡率为 30~80%，雪貂高达 100%。 病毒分离技术是对 CDV 特性的研究的重要手段，但具有囊膜的 CDV 不易在环境中存 活，因此难以用普通方法分离成功，限制其对 CDV 的研究。 信号淋巴细胞激活分子（Signaling Lymphocyte Activation Molecule, SLAM）是CDV 感染宿主的主要受体，本文旨在建立稳定表达不同动物（犬、狐狸、貉和水貂）SLAM 的Vero 细胞系，用于 CDV 分离和体外研究。用 PCR 的方法以克隆有犬、狐狸、貉和 水 貂 SLAM 的 pMD18-T （ 分 别 命 名 pMD18-T-cSLAM 、pMD18-T-fSLAM 、 pMD18-T-rSLAM 和 pMD18-T-mSLAM ）为模板扩增目的基因片段，将其定向插入到 真核表达载体 pIRES2-EGFP 中，得到重组表达载体 pIRES2-EGFP-cSLAMh 、 pIRES2-EGFP-fSLAMh 和 pIRES2-EGFP-mSLAMh 。将空载体和已构建完成的重组表 达载体分别用脂质体法转染到Vero 细胞，通过G418 和EGFP 筛选稳定表达的阳性Vero 细胞。用免疫组化的方法证实 SLAM 在传了 6 代转染重组质粒的细胞内的表达。成功 建立了稳定表达动物（犬、狐狸、貉和水貂）SLAM 的 Vero 细胞系，分别命名为 V-p-cSLAMh 、V-p-fSLAMh 、V-p-rSLAMh 和 V-p-mSLAMh 细胞系。 对建立的V-p-rSLAMh 细胞系进行稳定性、病毒分离敏感性和分离CDV 毒力评价。 6 次冻存复苏的 V-p-rSLAMh 细胞生长良好，说明细胞稳定性良好。将 V-p-rSLAMh 细胞系和 Vero 细胞分别接种 3 份 CD 阳性样品，接种 3 份样品后的细胞系在接毒 36～ 48h 形成典型的细胞病变（cytopathic effect， CPE ），而在 Vero 细胞连续盲传 6 代未 见犬瘟热病毒典型 CPE, 可见建立的细胞系在分离 CDV 方面比 Vero 细胞敏感。以 V-p-rSLAMh 细胞系分离到的 LN( （10）f1 株 CDV 进行貉和狐狸攻毒实验，每只的攻 2.39 毒剂量为 4 ×10 TCID50/只， 攻毒组 3 只貉和狐狸在 11～22d 死亡，正常对照组貉 和狐狸健康存活，说明分离的 CDV LN （10）f1 株具有较强毒力。H 基因序列分析表 明该CDV 强毒属于 Asia-1 基因型。 稳定表达 SLAM 的细胞系的建立为 CDV 的研究提供了一个有效的操作平台，同 时也为 CDV 强毒株的获得提供保障。 关键字 犬瘟热病毒；受体；信号淋巴细胞激活分子；Vero 细胞系 -I- Abstract Abstract Canine distemper (CD), caused by canine distemper virus, is a hightly contagious disease of mammals. CD is a epidemic disease infect larger number of fur animals breeding such as dog, fox, raccon dog and mink, the mortality rate ranging from 30% to 80% and 100% in ferrets, causing ines