斑马鱼红系造血陷突变体的正向遗传学筛选研究.pdfVIP

＼删㈣ 斑马鱼红系造血缺陷突变体的正向遗传学 筛选研究师迓针艽 硕士研究生：霍中军 导 师：张文清教授 摘 要 研究背景 造血过程是各种血细胞的发生、发育、成熟的过程，是一个多阶段、多步 骤、受到多个因子调控涉及多个造血解剖位置的复杂而又有序的动态过程，并 贯穿于生命体的一生。尽管各种血细胞组分的生理功能不同，但是它们有着同 stem cells，HSCs)。从HSCs向成熟血细胞 一祖先——造血干细胞(hematopoietic 分化的过程中，经历了造血祖细胞阶段和造血前体细胞阶段，最终分化生成所 有成熟血细胞。 经典的模式生物如线虫、果蝇等与人类谱系相距甚远，小鼠则是公认最好 的模式生物之一。然而，由于小鼠等哺乳类动物繁殖速度较慢，且体积相对较 大，胚胎予宫内发育，难以对早期造血的表型改变进行快速连续观察，因此限 制了其作为高通量化学遗传学造血缺陷突变体的筛选与基因鉴定等方面的应 用。斑马鱼作为脊椎动物，在基因组、蛋白质组、胚胎发育以及疾病发生机制 等方面均表现出与人类高度一致的特点。此外，斑马鱼还具有其他模式生物所 没有的独特生物学优势：1)个体小(体长3-4cm)，可在较小的空间内大量养 殖；2)体外受精且胚胎透明，其发育过程可在解剖体视镜下直接观察；3)产 卵数量多(每条雌性成鱼每周100-300枚)；4)胚胎发育较快，受精后24小时 多数重要的生命器官即开始发育，72小时左右小鱼即可出膜游泳；5)性成熟期 短(3个月左右)，此时即可以交配产卵；6)精子可冷冻保存；7)斑马鱼有30000 中文摘要 多个基因，87％与人类具有同源性；8)随着世界上使用斑马鱼的实验室及学者 的增多，有关斑马鱼的各项技术操作也日趋成熟完善，并且有专门的斑马鱼网 站等等。在对造血系统进行研究时，其发育早期身体透明，有利于在体视镜下 直接观察血液系统的发生发展：如血液的循环、心脏的跳动、血细胞的数量等； 并且血细胞的谱系及调节血细胞的基因与哺乳动物高度保守；并且斑马鱼心血 管系统早期发育与人类极为相似，而血液和心血管系统有缺陷的突变体仍然可 以存活数天，为该领域研究提供了极为有利的条件。鉴于这些优点，斑马鱼成 为了造血系统研究的最佳模式生物，尤其特别适宜于N一乙基一N一亚硝基脲 的筛选。 与哺乳动物类似，斑马鱼血细胞生成也分为原始造血(primitive hematopoiesis)和定向造血(definitivehematopoiesis)两个阶段，产生的分化细 胞组分与哺乳动物中发现的大多数成熟血细胞谱系类似。斑马鱼原始红细胞起 lateral 源于5体节时期后部侧向中胚层(posteriormesoderm，PLM)的一对双边条 纹，最终在20体节(somite)时期形成对应于哺乳动物卵黄囊的中央细胞团结 cell 构(intermediatemass，ICM)。这里是红细胞进一步分化、成熟，进入血液循 环，并于受精后5—7天(daypost lateralmesoderm，ALM)， 髓系细胞来源于10体节时期前部侧向中胚层(anterior 主要产生巨噬细胞和中性粒细胞。早期永久HSCs于受精后26—30小时(hours wall post ofdorsal blood 血岛(posteriorisland，PBI)迁移。最终造血干细胞在5dpf定居在肾脏， 这是成年斑马鱼的造血器官。 时具有双向分化功能的血液血管母细胞在腹侧中胚层分化(ventralmesoderm， VM)形成。随后，其向中轴线迁移，在12hpf到达侧向中胚层(1ateralplate