深海嗜热古菌Termococcus sp.4557的全基因组分析及其功能基因的初步研究.pdf

摘要 摘要 深海热液区的超嗜热微生物在独特的高温、高压、无氧等极端环境下，产生 与环境相适应的结构和功能独特的活性物质，因此被认为是一潜在的基因资源宝 库。对这些极端嗜热微生物的研究开发在工业，医药和环境保护等方面具有潜在 的、巨大的应用价值。 本研究首先从呱伊玛斯深海热液口沉积物中分离到一株超嗜热厌氧菌 4557。该菌株细胞为球形或成对存在，直径为1～1．2 lain。其生长温度范围为 celericrescens 根据16SrDNA序列分析，该菌株的最近缘菌株为Thermococcus TS21DSM sp． 4557。 为了深入了解Thermococcus sp．4557的分子特征，我们利用Solexa测序技 术对该菌株进行了全基因组测序以及基因预测与注释。测序结果表明，该菌株的 基因组由一个环状染色体构成，总长2．01Mb，不含质粒，GC％含量为56．08％， 共预测有2，194个基因，其中有2，144个基因编码蛋白，还有5个rRNA基因和 45个tRNA基因。比较基因组分析发现其85％的基因所编码的蛋白与其他 Thermococcus菌株的蛋白为直系同源蛋白，另外其还编码有308个特有蛋白，但 大部分为功能未知的蛋白。此外，通过全基因组信息分析，我们发现该菌株保持 了绝大部分Thermococcus属的的基本代谢特点和环境适应性机制。对 Thermococcus 究提供更多的信息，同时，也将为后续嗜热酶的研究提供良好的基因资源。 BDNA聚合酶由于其显著的热稳定性和3’一5’ 来源于超嗜热古菌的Family 外切酶的校对保真性以及以单体形式行使功能而成为一种热门的DNA聚合酶 酶。Thermococcus BDNA聚合酶(T4557 sp．4557的基因组中编码一个Family DNA聚合酶)，其氨基酸序列与Thermococcus sp．90N．7DNA聚合酶(D12983) BDNA聚合酶的酶学性质存在 的相似性最高，达93％。文献报道，不同Family 很大的差异，因此我们将T4557DNA聚合酶在大肠杆菌中重组表达纯化以及进 摘要 行酶学性质分析。结果表明，该酶具有较好的热稳定性和3’-÷5’外切酶活性， DNA聚合酶的1．16倍；在最佳的PCR反 但PCR扩增的保真性较低，仅为Taq 应缓冲液条件下该酶可扩增到长达8kb的DNA片段，具有扩增长片段的应用潜 BDNA聚合酶的研究提供更多的信息。 力。对该酶的研究将为Family 环糊精葡萄糖基转移酶(cylcodextrin 生产环糊精的重要工业酶，由于工业生产环糊精的过程需要在高温下进行，因此， 寻找耐热CGTase，并构建合适的异源表达系统实现CGTase的高效表达是 CGTase研究中的主要目标之一。我们在Thermococcus sp．4557的基因组中发现 一个含N端信号肽的CGTase基因(r4557 CGTase)，与其氨基酸序列相似性最高 KodakaraensisKodl 的是Thermococcus CGTase，为70％。最开始我们尝试在8 种不同的大肠杆菌表达菌株中重组表达T4557CGTase，但均没有得到有活性