病原菌细胞毒素感染相关高水平Ca2+诱导宿主细胞凋亡的作用与机制.pdf

及SMMC一772l细胞凋亡及其机制研究 浙江大学医学院 微生物学 博士研究生 赵金方 导 师 严杰教授 中文摘要 背景和目的创伤弧菌(啪rfD1，”加批船)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧 菌，主要生长于海水中。人类主要因生食污染的牡蛎等海产品或经创口而感染创 伤弧菌，引起原发性败血症或严重的创口感染，死亡率高达70％。创伤弧菌溶细 胞素(VibrioⅦlnificus cytolysin，VVC)是创伤弧菌最重要的致病因子之一．目前 认为，VVc是一种膜成孔毒素，能引起红细胞的渗透性溶解，对肥大细胞、肺内 皮细胞和巨噬细胞等则有细胞毒性。亦有报道证实创伤弧菌溶细胞毒素可诱导内 皮细胞细胞凋亡。为证明创伤弧菌溶细胞素是否可以通过凋亡方式诱导血管内皮 细胞及肿瘤细胞死亡，本研究中，我们采用基因工程技术重组表达了VVC 胞SMMC．7721为靶细胞，研究了rVVC对HUVEC、 的细胞毒性作用及机制。 BL21DE3 测序并构建wM基因原核表达系统E．coli pE“2和洲。采用Ni．NTA亲和 定rVVC表达量及提取物纯度。采用溶血试验检测rvVC溶解兔红细胞的活性， MTT试验检测rVVc对细胞活力的影响。2，4．二硝基苯肼比色法和四苯硼钠比色 LDH和K+含量。通过透射电子显微镜观察rVVC引起的细胞形态变化。采用流 H 进行定位。 结果 与GenBank中相关序列比较，所克隆的wM基因核苷酸和氨基酸序 列相似性分别为96．09％和98．26％。MTT试验结果显示1～100 Hg／mL的rvVC作 h后，细胞活力明显下降，呈剂量 用HUvEc、SGc．790l及SMMC．7721细胞4 依赖性。l (尸0．01)，但LDH含量无明显改变(尸O．05)。10rVVc处理HuVEc、 p咖L SGC．7901及SMMC．7721细胞4h后，细胞出现典型的凋亡特征性形态学改变； 流式细胞检测证实rVVc以时间／剂量依赖方式引起上述细胞凋亡。在rVVC诱导 min内， rVVC逐渐从细胞膜表面向膜内侧和胞浆内移行，作用30min时多数rVVC进入 细胞。 细胞发生凋亡是其损伤细胞的主要机制，wc诱导细胞发生凋亡的机制与 留在膜表面，而是很快进入细胞浆，在胞内发挥其毒性作用。 关键词 凋亡；caSpase。 lⅡ 第二部分钩端螺旋体赖型感染J774A．1和THP．1细胞后胞 内游离Ca2+水平变化及其诱导的细胞凋亡 中文摘要 背景和目的 钩端螺旋体(以下简称钩体)病是一种全世界流行的人兽共患 病，致病性钩体侵入人体后能引起能引起急性发热和全身各系统疾病，其最基本 的临床症状为出血和黄疸。钩端螺旋体的致病机制至今未明。在很多病原菌．宿主 模式系统中，胞内游离Ca2+水平变化是一项非常重要的信号传导机制。业已报道， 许多致病菌黏附宿主细胞后能引起胞内游离Ca2+水平升高，从而触发一系列Ca2+ 依赖信号传导，引起细胞骨架重排，介导细菌内吞。在吞噬细胞对抗病原菌的反 应中，Ca2+也是极为重要的第二信使，而病原菌也发展出了多种方式来对抗这些 钙依赖性反应，如诱导吞噬细胞凋亡、不被吞噬、从吞噬泡中逃逸，改变胞内途 径等。为了了解钩体感染细胞时是否能引起胞内ca2+水平升高及ca2+水平变化机 制，并进一步了解其引起的胞内Ca2+水平变化与细胞凋亡的关系，本研究采用 Fluo．4／AM胞内游离Ca2+荧光染色激光共聚焦技术检测了致病钧体赖型感染 来源及阻断前后