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基本操作技术和要求 原代培养 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持 培养细胞生长状况的观察 细胞冻存与复苏 细胞培养污染的检测和排除 基本操作技术和要求 无菌技术目标— 消除污染 无论什么时间对培养物进行处理都要肉眼和显微镜仔细检 查培养物 培养物应在无抗生素培养基中生长一段时间培养物应在无抗生素培养基中生长一段时间，，以发现隐藏以发现隐藏 的污染 使用前，要亲自对试剂进行无菌检查 培养及各种瓶子不能与其他人共用，且不能用于不同的细 胞系 任何时候都要保持无菌技术高标准 培养室内的无菌操作 工作的要求：有条不紊 完全可靠 • 培养前的准备：制定好实验计划和操作程序 书面准备：实验程序、试剂配制计划、所需物品 操作准备操作准备：：准备所需物品准备所需物品、、清点清点 注意考虑意外情况 培养室和超净台的消毒 培养室消毒 超净台处理 • 培养室0.2%新洁尔灭拖地 • 实验前乙醇擦洗 • 紫外照射30~50 min • 紫外消毒30 min 视情况而定，个人保护 • 用品放置不重叠 • 先乙醇消毒，再紫外灭菌 洗手和着装 原则上彻底洗手，按外科要求着装 实验前手的消毒 实验中手的消毒 无菌衣的放置和处理无菌衣的放置和处理 不统一 根据自己实验室的情况而定 无菌培养操作 用品布置有序、合理 实验前，点燃酒精灯 所有操作在火焰近处并经过火焰烧灼进行 吸管不混用、不接触瓶口、向下倾斜放置 瓶口不过早打开瓶口不过早打开，，不垂直放置不垂直放置 烧灼：器械、移液管、培养瓶、胶塞、塑料用品 吸管：放置方法、棉塞 操作中：讲话、咳嗽 创造无菌环境的各因素 — — 安静的工作区域 • 减少人的过往和活动，与动物微生物培养区分 • 干净无灰，无多余设备 • 不进行非无菌操作 创造无菌环境的各因素 — — 工作面洁净原则 • 开始工作前的洁净 • 只带针对某一流程所需物品，移走不需要物品 • 整理工作台，取物不跨越 •• 中央有宽敞操作空间中央有宽敞操作空间 • 在视野范围内工作 • 随时擦去任何溢出物，并用乙醇擦洗 • 实验完毕，移走物品，彻底清洗工作面 创造无菌环境的各因素 — — 个人卫生 洗手可湿润手部，带走干的皮屑 可戴外科手套，并时常擦拭消毒 可不戴手套，提高灵敏度 感冒尽量避免做实验感冒尽量避免做实验 指甲 创造无菌环境的各因素 — — 技术训练 新手进入无菌工作区，技术和程序训练十分必要 工作前，到训练有素的操作者那里进行3个月的学习 数周的操作技能和基本理论知识数周的操作技能和基本理论知识 一段不用抗生素的跟踪期 换液— 传代— 原代的培养过程 绘制生长曲线训练 无菌技术举例 — — 更换培养基 检查细胞，确定怎么处理 处理工作台 准备所需物品 紫外灭菌 将培养基等试剂瓶放于工作面 取吸管取吸管，，加吸头加吸头 打开培养瓶，弃去旧培养基 弃吸管 换新吸管，加入新培养基 弃去吸管，拧盖 培养瓶放于培养箱，培养基放于冰箱 清理物品，擦地面 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是 原代细胞培养成功的首 要条件要条件，，直接影响细胞直接影响细胞 的体外培养。 取材的基本要求 • •1 ．取材要注意新鲜和保鲜 • •2 ．应严格无菌— — 准备和操作 • •3 ．