石刁柏Ty1-copia类反转座子Aocrt4的克隆与分析.pdfVIP

摘要 石刁柏是一种常见的雌雄异株植物，染色体组成为2n=20，具有一对处于迸化初期 的同型性染色体XY，但是，至今尚未获得确切的核型及同型性染色体直接的细胞学证 据。石刁柏的染色体组具有不稳定性特征。主要表现在，存在异型的常染色体对，B染 色体数目不固定以及不同品种间的核型在着丝点位置和随体位置方面有差异。故，石刁 柏既是研究性染色体进化、两性植物起源和植物性别决定机制的模式植物，也是研究植 物基因组和染色体组稳定性的良好材料。 反转座子是可以在染色体间移动的DNA片段，其活动与基因组和染色体组的稳定 性、基因的表达、染色质重塑等细胞学行为之间具有高度的相关性。 鉴于此，本文以石刁柏及其同属的文竹为材料，利用PCR、RT-PCR、染色体原位 杂交等技术，通过相关生物信息学的分析，对获得的一个石刁柏反转座子的序列特征、 拷贝数、转录活性及染色体定位进行了研究，并对其在石刁柏染色体组进化中的作用进 行了探讨，为石刁柏染色体组的进化提供基础资料。主要研究结果如下： 1以石刁柏和文竹为材料，利用兼并引物对Tyl．copia反转座子进行克隆和分析。 结果显示，从石刁柏及文竹基因组中均获得了长约260bp的预期条带。测序及序列分析 发现，该序列属于Tyl．copia类反转座子的反转录酶基因保守区序列。 石刁柏间无明显差别，说明该反转座子仍具有转录活性，且雌雄性别间的转录活性没有 基因组中的总拷贝数分别为2996和4572，每1C的拷贝数分别是558和589，这说明 该反转座子的分布与性别没有明显相关性。 3．为了分析Aocrt4是否具有种内异质性，本研究分别选择石刁柏雌、雄各3株及 文竹1株，用特异引物分别对这7个目标基因组进行扩增，对每个扩增产物随机挑选8 个单克隆进行测序分析。结果发现，总共获得的48个序列长度分布在244．245 bp之间， 平均相似度为97．72％，表现出较低的异质性。雌雄间和同性别的不同株间序列的相似 度没有显著的差异。通过对变异位点进行分析发现，在48个序列中共有266个突变位 点，除两个位点是单碱基缺失外，其余均为碱基置换，且多为G／CH～T。对石刁柏和 文竹中的该反转座子序列比较，发现其种间异质性高于种内异质性。通过Aocrt4的氨基 酸序列比对发现，该序列共编码83个氨基酸，有12个序列发生了终止密码子突变，突 变位点集中在第47和48个氨基酸位置；2个氨基酸序列发生了移码突变；在第43、49 和73个氨基酸位置都分别存在两种氨基酸，依次分别是组氨酸(H)／酪氨酸(Y)，组氨 氨酸占93．8％。除此之外，所有的氨基酸序列表现出了高度的保守性。 4利用染色体原位杂交技术对Aocrt4进行定位。结果发现，该反转座子被定位到了 石刁柏的第7对染色体上，而且该染色体对表现出异型特征。同时发现，在其余染色体 上也有较弱的荧光信号出现，也说明该反转座子可能是一个具有转录活性的反转座子。 另外，用45S rDNA作探针时，杂交信号被定位到石刁柏的第1号、2号和5号染色体 上。用这两种探针进行双杂交时，杂交信号被定位于石刁柏的1号、2号、5号和7号 染色体上。再结合本实验室用5SrDNA的研究结果，可以获得石刁柏精确的染色体配 对结果。 关键词：石刁柏，Aocrt4，反转座子，Tyl—eopia，染色体进化 II ABSTRACT L．isa dioeciouswith2n--20 its Asparagusofficinalis sex plant chromosomes，andhomotypic chromosomesXYareinthe ofchromosomes thereisstillnoexact earlystages evolution，but karyotype anddirect evidenceofthe sex