小鼠CD147胞外区结构域的表达纯化糖基化初步分析.pdf

1 小鼠CD47胞外区结构域的表达纯化及 糖基化初步分析 硕士研究生：葛 亮 指导教师：张嘉宁 教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘 要 背景及目的： 恶性肿瘤侵袭和转移的特性使其成为威胁人类生存的三大疾病之 一。肿瘤的转移和侵袭是一个多步骤的复杂过程，是治疗恶性肿瘤的主 要障碍和造成肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤转移的方式主要有淋巴道 转移、血道转移和种植性转移。相关研究表明，肿瘤细胞表面的糖蛋白 的糖基化形式和糖链结构与肿瘤转移密切相关。 1 是细胞膜的监视分子。CD47由2个胞外Ig结构域、1个跨膜结构域和 1个胞内结构域组成。胞外区有3个Asn糖基化位点。由于N．糖基化不 l l47 同，CDl47可以同时表现为高糖型CD 47(HG．CDl47)和低糖型CD 47 主要通过诱导基质金属蛋白酶 (matrix (LG．CDl47)。CDl 炎症及肿瘤转移。胞膜窖(Caveolae)是细胞表面胞膜内陷形成的结构。 展的多方面、多环节上发挥着关键的调控作用。 l 本实验室已有研究表明：在小鼠肝癌细胞系中，CD47糖基化程度 1 与肿瘤转移能力正相关。HG．CD47在高淋巴道转移潜能的小鼠肝癌细 胞(Hca．F)中表达量较高，在低转移细胞株(Hca．P)中表达量较低， 而LG．CDl 47在无转移潜能的小鼠肝癌细胞株(Hepal．6)中占主要部分。 l 另外，CD HG．CDl 1 47表达减少，LG—CD 1 l 中HG．CD47表达量上升，而LG．CD47蛋白表达量显著降低。 l 本文旨在通过构建小鼠CD47胞外区分泌型质粒，在Hepal．6及 l47胞外区蛋白。通过对比有无 Hepal．6／Cav．1细胞中表达并纯化CD 1 l47 Cav-l存在两种条件下CD47胞外区蛋白的糖型和糖链结构，推测CD 1 糖基化与肿瘤转移的关系及Cav．1对CD47糖基化调节的分子机制。 实验方法： 47的构建 1．重组表达载体pCDNA3．1／CDl 147胞外区结构域的基因。将 PCR获取小鼠肝癌细胞Hepal一6中CD 1 分泌型信号肽及CD47胞外区嵌合基因插入到表达载体pCDNA3．1中， 构建分泌型真核表达载体pCDNA3．1／CDl47。 l 2．pCDNA3．I／CD47在Hepal，6及Hepal．6／Cav．1中的表达纯化 147瞬时转染至Hepal．6 利用脂质体将重组表达载体pCDNA3．1／CD 融合蛋白的表达。在此基础之上进行大量转染，利用Ni．NTA亲和层析 3．CDl 47．His融合蛋白的生物活性检测及糖基化初步分析 利用纯化所得融合蛋白刺激小鼠成纤维细胞，明胶酶谱法检测其分