牛肠激酶催化亚基cDNA克隆、表达及表达产物纯化和应用.pdf

摘要 中文摘要 指肠内的丝氨酸蛋白酶，可沿胰蛋白酶原序列中(Asp)；一Lys的羧基端切下，从 而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其 成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂 解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、羟胺等化学试剂，肠激酶 具有非特异性切割极少，反应条件宽泛，切割位点在全部识别序列之后，切出的 耳标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。本文首次对中国北方黄牛肠 激酶基因催化亚基(EK。)编码序列eDNA进行了克隆并分别在大肠杆菌与毕赤酵 母中实现了表达，得到如下结果： 首先从市售中国北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增 EK。cDNA片段，将此片段克隆于pGE旷一TEasy载体中，经过特异性限制性内切酶酶 切分析片段正确后，进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序 列相比完全一致，得到了编码正确的牛Enterokinase催化亚基基因片段全序列。 统中成功表达了带(His)。亲和标记的重组肠激酶催化亚基。经条件优化后，重 组肠激酶催化亚基融合蛋白DsbA—EK。一(His)。可溶性表达量占裂菌上清总蛋白 的18％以上。采用变性上柱、柱上复性方式进行镍亲和层