以果蝇表达栽体统构建可高效表达rsv g、rsv m的s2细胞株.pdf

M G、RSV 以果蝇表达载体系统构建可高效表达RSV 的S2细胞株 中文摘要 virus，RSV)是全世界范 摘要：人呼吸道合胞病毒(Human syncytial respiratory 围内引起婴幼儿，老年人、心肺病人及免疫缺陷病人下呼吸道疾病最重要的病原， 是一种非分节段，负链RNA包膜病毒，属于副黏液病毒科。病毒基因组全长15．2 RSV主要中和抗原，基质蛋白(Matrix protein，M)则在病毒的装配，出芽及病毒 颗粒的形成中扮演着重要角色。因此，对RSVG蛋白、M蛋白的大量表达与纯化， 是RSV诊断试剂，亚单位疫苗及病毒样颗粒(VLPs)疫苗研制中需要首要解决的 问题。 Bac．to．Bac杆状病毒表达系统是制备RSV主要蛋白的常规方法，但存在纯化 困难及操作繁琐等问题。而果蝇表达系统(Drosophilaexpressionsystem)采用简 单的载体及直接的转染方法，得到稳定表达的细胞系，可以较好地弥补杆状病毒 系统的缺陷，同时也能够生产高表达水平的重组蛋白。 G、RSVM的四种S2 本论文采用果蝇表达载体系统，构建了可高效表达RSV 细胞株。将目的基因通过PCR扩增获得含信号肽的目的基因，与T载体连接后， 转化大肠杆菌DH5ct，并小提质粒，测序，酶切，回收目的基因，将其克隆进果蝇 A中，获得带有目的基因的重组质粒，酶切后进行凝胶电泳 表达载体pMT／V5．His 鉴定；大提重组质粒后，将其与抗性筛选质粒pCoHygro共同进行磷酸钙转染S2 细胞；转染完成后，采用300 gtg／ml的潮霉素B筛选，3．5天换一次培养液，持续 h后 培养四周后获得稳定表达的细胞系；采用终浓度为500HM的CuS04诱导48 获得目的蛋白并用Western G， blot鉴定及初步纯化。 sM，sM．His四种蛋白的细胞系，并对其进行了Western 关键词：人呼吸道合胞病毒，果蝇表达系统，G蛋白，M蛋白 分类号：Q51 RSVM RSVGand Expression of Drosophila HighExpression inS2Cells Vectors ABSTRACT an enveloped virus(RSV)is ABSTRACT：Humansyncytial respiratory into RSV