洋甘菊sqs基的克隆与鉴定及不同器官挥发油成分分析.pdf

万方数据 摘要 洋甘菊又称母菊，为菊科母菊属一年生草本植物，具抗炎、抑菌、抗病毒、 抗癫痫等作用。其主要活性成分为母菊薁、没药醇等倍半萜类物质。角鲨烯又名 鲨烯，为三萜皂苷、甾体和固醇等生物合成的前体，具有增强机体免疫能力、改 善心功能、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老等多种生理功能，是由角鲨烯合酶 （squalene synthase SQS (farnesylpyrophosphate FPP) ， ）催化法尼基焦磷酸 ， 所得。倍半萜与 角鲨烯的生物合成属于 FPP代谢的两条重要支路，角鲨烯合酶的活性可影响单 萜、倍半萜和二萜等其他类异戊二烯途径中其他支路的生物合成，其中影响最大 是倍半萜类的生物合成。本实验克隆了 SQS基因 cDNA全长，检测了 SQS蛋白 的活性，比较了洋甘菊不同器官挥发油的化学组分，为研究洋甘菊萜类合成途径 及开发利用提供分子基础。主要研究结果如下： 1. 克隆了洋甘菊 SQS基因 cDNA全长。通过简并 PCR技术扩增了洋甘菊 SQS基因的部分片段，利用RACE技术从洋甘菊中首次克隆了SQS基因的cDNA 全长。利用生物信息学方法分析了 SQS的蛋白质结构。 2. 体外酶活实验检测了洋甘菊 SQS蛋白酶活。扩增 SQS基因的 ORF框， 连接到 pET-28a(+)的表达载体中，再把重组子转化到DE3表达菌中，构建原核 表达工程菌，经过 IPTG诱导，表达条件的优化，成功表达了 SQS蛋白，分子量 47KDa GC-MS SQS 15.012min 约为 。 技术检测 蛋白活性，结果显示：在 出现角 鲨烯波峰，表明该蛋白具有角鲨烯合酶的活性。 3. 利用 qRT-PCR检测了 SQS基因在洋甘菊开花阶段舌状花冠、管状花冠、 茎和叶中 mRNA 的相对表达量。结果表明：SQS基因 mRNA转录本积累量在管 状花冠、叶、舌状花冠和茎中呈依次递减，管状花冠中的表达量是舌状花冠的 11.2倍，叶中的表达量是舌状花冠 3.2倍，茎中表达量是舌状花冠的 0.7倍。 4. 利用 GC-MS技术比较了洋甘菊舌状花冠、管状花冠、茎和叶中的挥发油 的化学成分及含量。结果表明，茎、叶、舌状花冠、管状花冠状花冠中分别鉴定 出43、46、66、68种化学物质。不同的器官所含挥发油的化学成分和含量有较 β- 6.75% 7- 大的差别。洋甘菊管状花冠挥发油中化学成分主要有： 没药烯 、 甲氧 基香豆素 11.01%、ɑ-没药醇氧化物 A 12.9%和茼蒿素 34.90%等；叶挥发油化学 成分主要有：α-法尼烯 5.52%、7-甲氧基香豆素34.72%和茼蒿素等 37.18%；舌 7- 64.86% 6.19% 状花冠挥发油化学成分主要有： 甲氧基香豆素 和二十四烷 等；茎 挥发油主要化学成分为：甘香烯 3.55%和 7-甲氧基香豆素24.90%。洋甘菊管状 花冠、叶、舌状花冠和茎中挥发油相对含量比例为 2.31：1.66：1.60：1。倍半萜 25.56% 21.8% 在各器官的相对含量百分比从高至低依次为