小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞基因芯片分析.pdfVIP

。。‘ ‘PapersResearch PI13窟栽箨岔…妇 www．pibb．ac．cn 小鼠胚胎干细胞分化为,EJT坌EI胞的基因芯片分析宰 李岩李雪飞 郭坤 高东梅赵燕 刘银坤” (复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海200032) 摘要弄清胚胎肝脏发育的分化调节机制，对指导干细胞在肝再生中的应用以及研究肝分化相关疾病分子机制具有重要意 义．胚胎干细胞的全能性使得体外建立肝向分化模型成为可能，采用单层贴壁培养方式，分阶段加入成纤维细胞生长因子 镜下呈现肝样细胞形态，RT．PCR、细胞免疫荧光检测以及PAS染色分析表明，这些细胞具有肝细胞特征性的基因表达和生 化功能．采用于细胞分化相关基因芯片比较早期肝定向分化前后的基因表达差异，结果显示，48个差异表达基因中(大于2 倍)，20个上调、28个下调．进一步的生物信息学分析发现，它们集中体现在细胞外基质、细胞连接、FGF、BMP分子及 Noah、Wnt信号通路上，提示这些改变可能与胚胎早期的肝向分化密切相关． 关键词胚胎干细胞，肝细胞，细胞分化，基因芯片 学科分类号Q254 DOI：10．3724／SP．J．1206．2008．00010 胚胎干细胞的无限自我更新能力及多向分化潜 康星大学馈赠． 能使其可能成为一种良好的再生细胞资源．尽管人 1．1．2细胞培养基．n1ESC．D3培养基：高糖型 们在胚胎干细胞的肝向分化方面已开展了大量研究 0．1mmol／L 工作【t~明，这个领域目前仍处在萌芽阶段，分化率 B．巯基乙醇、1％非必需氨基酸、l％丙 低、细胞不成熟是突出问题，得到有完全功能的成 酮酸钠、100 熟肝细胞一直是所有研究者的努力目标【9埘．鉴于 l 000 自然过程中肝脏发育的复杂性，综合模拟其中涉及 inhibitory 的各种信号对实现高效、可重复的分化是相当重要 养基：不含LIF的mESC．D3培养基．饲养层小鼠 的．另外，随着近来“肿瘤干细胞”概念的提出， 胚胎成纤维细胞(mouseembryonic 肝癌细胞起源涉及的异常分化调节也开始引起人们 培养基：高糖型DMEM，含10％胎牛血清． 的重视【1l～14]．所以，着眼于分化机制的研究，对于1．1．3诱导因素．酸碱性成纤维细胞生长因子 将来干细胞在肝再生上的应用以及阐明肝癌发生的 异常分化调节机制都具有重要意义．基因芯片技术 的应用使得同时分析生物过程中多个调节通路成为 塞米松、牛血清白蛋白、维生素C(Sigma公司)； 可能．本研究参照小鼠胚胎肝脏早期发育的阶段 ITS(Gibco—BRL公司1． 1．1．4 性，采用FGF、HGF、OSM等因子，体外建立了 小鼠胚胎干细胞的肝向分化模型，首次采用干细胞 试剂盒、Taq 分化相关的功能分类基因芯片分析早期肝定向分化 PCR试剂盒(北京天根生物公司)；引物由上海生工 前后的基因表达差异，为进一步寻找分化关键基 生物公司合成，引物序列见表I和表2． 因、阐明分化调节机制提供线索． 1材料和方法 +国家。十五”科技攻关资助项I目(2004BA703802)． ··通讯联系人． 1．1实验材料 收稿日期{2008-05．30。接受日期：2008-09．11 1．1．1胚胎干细胞来源．mESC—D3