尼古丁对血管内皮细胞表达间粘附分子-1及基因转录调控与信号转导的影响.pdf

尼古丁对血管内皮细胞表达细胞间粘附分子一1及其基 因转录调控和信号转导的影响 研究生： 周卫辉 导 师： 陈祥银研究员 导师组成员： 孙仁宇研究员 摘 要 | L流行病学调查发现吸烟是慢性阻塞性肺疾患、动脉粥样硬化等多种疾病的 主要危险因素之一，但吸烟促使这些疾病发生的详细机制尚未完全明了。 近年来的研究资料表明，白细胞活化、聚集以及白细胞与内皮细胞的粘附 在炎症性疾病的发病中起重要作用。白细胞与内皮细胞的粘附依赖于细胞表面 各种粘附分子的表达，而细胞间粘附分子一l(ICAM一1)是内皮细胞表面最主要 的粘附分子之一，并且在介导白细胞与内皮细胞粘附、跨越内皮细胞向血管外 迁移等过程中起着关键性的作用。 临床观察和动物实验发现吸烟可促使白细胞与内皮细胞的粘附。尼古丁是 香烟烟雾中的一种主要成分，在吸烟诱发机体的各种反应中起着十分重要的作 用，尼古丁在吸烟促使白细胞与内皮细胞粘附当中究竟起到什么作用还鲜有报 、 道。r}本文利用体外原代培养的人脐静脉内皮细胞(HuVEc)为靶细胞，观察尼古 V 、、、．—．．．．．．．．—。—．．—，．．—～ 丁对白细胞与内皮细胞粘附、内皮细胞表达ICAM—l的影响，并探讨其对IcAM— l基因表达的信号传导通路和转录调控的作用，同时观察具有抗炎作用的764一 、_，_。1’4～_‘。————一’ 3(从丹参中提取出的单体)对尼古丁上述作用的影响。粥有助于阐明尼古丁 、 在炎症性疾病发病中的分子机制并为寻找有效的防治炎症损伤的措施提供新的 p、 思路。上， !里坠塑垦型查堂堕主竺丝苎 三 ，7本工作的主要结果如下： 1．观察到尼古丁可促使中性粒细胞与内皮细胞的粘附。 杂交的方法检测ICAM—lmRNA表达，观察到尼古丁可分别促进两者的表达，且 呈时间和剂量依赖的趋势。以上结果表明尼古丁在基因转录水平诱导ICAM—l 表达。 3．成功地构建了四种含人IcAM一1基因不同长度的启动子序列和两种含顺式 作用元件发生定点突变序列的荧光素酶报告基因质粒，为研究尼古丁及其他因 素诱导ICAM一1基因表达的转录调控机制奠定了基础。 4．用真核细胞转染技术分别将四种含人IcAM一1基因不同长度启动子序列 的报告基因质粒导入人脐静脉内皮细胞，然后用尼古丁刺激转染的内皮细胞， 序列的报告基因质粒表达荧光素酶，而含有一134／+36序列的报告基因质粒对尼 古丁诱导无反应，表明尼古丁诱导ICAM一1基因表达依赖于启动子中一230bp和 一134bp之间的序列。 5．IcAM一1基因启动予中的顺式作用元件下游NF—K B结合位点和sp一1结 合位点分别位于一230bp和一134bp之间。将两种含有下游NF—KB结合位点和Sp—l 结合位点发生定点突变序列的报告基因质粒转染内皮细胞及用尼古丁诱导，观 察到尼古丁可促使含有IcAM一1启动子中Sp—l结合位点发生定点突变序列的报 告基因质粒表达荧光素酶，而含有中NF—x B结合位点发生定点突变序列的报 告基因质粒对尼古丁诱导无明显反应，提示尼古丁诱导ICAM一1基因表达依赖 于其启动子中的顺式作用元件NF—KB结合位点。 6．用激光共聚焦显微镜观察到尼古丁可促使内皮细胞胞内游离钙离子浓度 ([ca”]i)的增加，钙通道阻滞剂尼莫地平可拮抗尼古丁的此种效应。 7．用Y一“P—ATP掺入法检测PKC活性，观察到尼古丁可引起内皮细胞的PKC 活化。 ±里堡塑堕型查兰竖圭兰堡壅——1 法检测Ras蛋白，观察到尼古丁可引起内皮细胞Ras蛋白的活化a 9．利用上述方法观察到764—3可分别抑制尼古丁诱导的中性粒细胞与内皮