恶性疟原虫surf家族在红内期转录水平和红细胞胞浆内转运机制及其氯喹通过抑制TLR9抵抗脑疟发生的免疫机制研究.pdf

·中文论著摘要· 恶性疟原虫surf家族在红内期转录水平和红细胞胞浆 内转运机制及氯喹通过抑制TLR9抵抗脑疟发生的免 疫机制的实验研究 实验目的 疟疾是由蚊媒传播的热带地区最常见的寄生原虫感染性疾病。恶性疟原虫是 最具致死性和危害性最大的原虫种属。全球每年有3～5亿人感染恶性疟原虫，200 多万人死亡。红内期中红细胞表面表达的原虫抗原是介导各种临床症状的病理基 础，同时也是宿主保护性免疫系统作用的靶点，如：恶性疟原虫红细胞表面抗原 ．1(PfEMPl)，可介导原虫感染红细胞黏附于微血管壁和未感染红细胞，引发脑 疟和胎盘疟疾发生。脑疟(CerebralMalaria，CM)是疟疾感染后最为严重的临 床症状，仅撒哈拉南部非洲，每年有100万5岁以下儿童死于恶性疟原虫感染。 由于抗药疟原虫和耐杀虫剂蚊的出现，在过去数十年中，开发新型有效的措施以 抑制此种感染性疾病已成为全球亟待解决的问题。 近年研究发现一大分子量原虫分泌蛋白家族——恶性疟原虫表面相关散布 基因家族(surface—associated interspersedgene，J甜棚，表达于感染红细胞表面， 可能是介导脑疟发生的恶性疟表面抗原之一。同时，免疫学相关研究表明，前炎 症细胞因子的过度释放可介导脑疟发生。TLR9是参与CM发病的重要分子，主 要通过在脑组织募集免疫细胞，诱导Treg和／或协同IFN-7信号来促进CM发生。 CQ现在被用作胞内酸化(TLR3、7、8和9活化所必需)抑制剂来治疗自身免 疫病。因此，疟疾感染过程中，CQ可能通过TLRs来影响DCs的功能，从而调 节固有免疫应答以及随后的适应性免疫应答，为抑制的脑疟发生提供可能。 为此，本研究通过分子生物学和免疫学手段，检测不同原虫株(实验株：3D7A 转录水平和转录模式，探讨其作为疟疾感染阻断疫苗候选抗原的可能性。通过构 fluorescence 建融合表达SURFIN4．1蛋白的不同区域与Ty和绿色荧光蛋白(C,reen 1 印迹(WesternBlot)检测融合蛋白表达情况；通过间接免疫荧光(IFA)检测荧 光信号定位，从而明确SURFIN4．1在感染红细胞内的定位和介导此蛋白转运的蛋 白序列，为进一步的功能分析提供理论依据。并在体内研究了CQ对实验性脑疟 模型(P6．ANKA感染C57BL／6小鼠)中宿主免疫应答的影响。从而为恶性疟的 防控和治疗工作提供充实的理论和实验依据。 实验方法 1、恶性疟原虫体外培养 1 MS822株。其中3D7A，3D7B，MS814A1和MS8 法同步化处理后，进行s．rf家族成员转录水平的检测；MS822株为转染原虫宿 主株，经相同方法同步化处理后，在裂殖体期原虫5％时，可用于转染。 2、总RNA的提取和反转录获取cDNA 按TRIzol LS试剂使用说明提取总RNA。用紫外分光光度仪检测其吸光度 (A260／A280值)，检测RNA纯度并计算其浓度。反转录采用随机引物法，按 SuperseriptlII试剂使用说明操作，获得的eDNA于．20℃保存备用。 3、质粒构建 的制备，SURFIN4．1蛋白编码基因中各功能域相关引物的设计。目的片段采用常 规PCR方法扩增，采用凝胶回收提取试剂盒纯化PCR产物后，用于质粒构建。 4、实时荧光定量PCR测定及熔解曲线的分析 SYBR 实时定量PCR的反应体系为2xPower green反应混合物12．5止，eDNA 模板2m，10 2 95℃15 min；95℃10mira s，62℃lmin；68℃7s；共50个循环。循环结束 后进行熔解曲线分析。在同一次反应中设置标准质粒反应组(4个浓度分别lx108、