遗传学实验甜蜜素对蚕豆微核形成的影响.docVIP

诱变物质的微核检测技术 1.引言 微核：间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。微核是染色体畸变的一种表现方式。 引起染色体断裂的因素分为物理因素和化学因素。物理因素包括：具有能量的各种射线，如α射线，β射线，γ射线，X-ray，中子，质子，UV等。化学因素包括：诱变剂和重金属等。经典断裂剂：Ｘ射线。诱变剂：环磷酰胺、氧化铬CrO3、叠氮化钠NaN3、甲基璜酸乙酯EMS、硫酸二乙酯。 微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。微核技术获得的结果与通过中期畸变染色体计数所获结果相当。 甜蜜素，其化学名称为环己基氨基磺酸钠 ，是食品生产中常用的添加剂。甜蜜素是一种常用甜味剂，其甜度是蔗糖的30～40倍。消费者如果经常食用甜蜜素含量超标的饮料或其他食品，就会因摄入过量对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒的能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显。甜蜜素在人体内不能被新陈代谢，但肠内细菌可使之降解为环己胺，而环己胺是致癌物质。1969年，有人报道，其对大鼠可诱发膀胱癌，该试验也获得了日本有关部门的认可，美国FDA禁止其加入食品或作为食品添加剂。孟加拉国在2007年开始禁止使用甜蜜素作为食品添加剂。而欧盟也在2000年和2003年两次调整甜蜜素的最高限定值。而我国至今仍然没有调整甜蜜素的限定值，其已经超过欧盟限定值的2.5倍。国FDA明文禁止我们甜蜜素至今世界上明确准用的有中国、欧盟、德国等80多国；而明确禁用的有日本、美国等45 国。 2.1实验材料 大蒜，蚕豆，甜蜜素，0.1mol/L NaN3，1mol/L盐酸,酒精，乙酸，水，纱布，培养皿，改良苯酚品红,载玻片，盖玻片，解剖针，显微镜，刀片。 2.2实验方法 2.2.1材料的获取及处理 取材： 大蒜：于24 ℃水中浸泡24-36 h,选择根长整齐一致，不定根长约0.5－1cm左右的大蒜随机分组。 蚕豆：于24 ℃水中浸泡36 h,湿纱布包裹催芽36 h,选已发芽的蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中培养36 h,每12 h用水冲洗1次,换水培养。选择根长整齐一致,根长约1.0～1.5 cm的蚕豆随机分组。 培养： 将蚕豆、大蒜分别分为五组，分别用水、0.175g/ml甜蜜素、1.75×10-2g/ml甜蜜素、1.75×10-3g/ml甜蜜素和叠氮化钠培养。用40mmol/L的叠氮化钠培养大蒜，用20mmol/L的叠氮化钠培养蚕豆。同时同条件培养24小时。之后清水恢复培养24小时，用卡诺固定液最后固定24小时，再用70%的乙醇4℃下保存。 解离： 固定后的材料用清水洗涤后，大蒜用1MHCl处理10min，水洗三次；蚕豆28℃下根尖用5MHCl 处理25-50min, 水洗3次。在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。然后水洗3次。 染色： 大蒜切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10min。蚕豆切取近根尖分生区的伸长区组织，捣碎，用改良苯酚品红染色20 min。 2.2.2染液的制备 改良苯酚品红，其制备过程如下： 原液A 3g碱性品红溶于100ml 70%乙醇中。 原液B 取原液A 10 ml加入90 ml 5%的苯酚水溶液。 取原液B 45ml加入6ml 冰乙酸和6ml 37%的甲醛。（适合于植物原生质培养中的细胞核染色）取2-10ml染色液，加90-98ml 45%的醋酸1.8g山梨醇。（适合于细胞核的染色，只有细胞核及染色体被染成紫红色，而细胞质不着色） 2.2.3制片及镜检 压片： 加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。 镜检： 每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。 0.175(203g/kg)甜蜜素由于浓度过大，导致细胞脱水死亡，蚕豆、大蒜都未能成功存活。 蚕豆中其他组可能由于处理时解离时间不充分，以及染色时间不足未能成功染色，造成无法观察细胞结果。实验失败。 大蒜组实验结果良好： 培养溶液(g/ml) 水 1.75×10-3(2.03g/kg)甜蜜素 1.75×10-2(20.3g/kg)甜蜜素 0.175(203g/kg)甜蜜素 40mmol/L的叠氮化钠 微核率（‰） 0 10 30 死亡 比率并不是很大 表格 1 大蒜组微核实验结果 由上表可知，液体类食品中，甜蜜素的最大使用量为0.65g/kg。试验中浓度最低为2.03g/kg，其微核率为10‰,有效最高浓度为20.3g/kg，相对应的微核率为30‰，根据“微核发生率同作用因子的剂量呈正相关”，由此估算，液体类食品中，当其浓度为0.65g/kg时，其微核率为0.71‰。因此由实