11核酸化学2DNA的结构和特性.pptVIP

* * * 重组DNA技术的基础Basis of Recombinant DNA Technology DNA与限制性内切酶 双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断, 又可以被连接酶再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和重组DNA技术的基础。 大部分限制性内切酶识别的碱基序列为 6 个碱基的回文(palindrome )序列。它们在微生物细胞内扮演的却是防御外来DNA入侵的国防军的作用。如何不把自身的DNA也降解了呢？ DNA重组示意图 EcoRI与DNA的复合体 DNA的变性与复性 -人类基因组中重复序列的发现 DNA双螺旋结构模型，不仅与其生物学功能有密切关系，还能解释DNA的重要特性--变性与复性，这对于深入了解DNA分子结构与功能的关系有重要意义。 DNA变性 (Denaturation) 1、DNA变性的概念：指DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。 2、DNA变性的本质：维持双螺旋稳定的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，不涉及到一级结构的改变。 3、导致DNA变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺、低离子浓度等，均可引起核酸分子变性。 DNA分子的变性 DNA变性：双链解开。 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度增加 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 RNA变性：从局部螺旋到线团之间的转变，RNA的变性引起的性质变化没有DNA的明显。 变性后理化性质的变化 DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象与结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm, melting temperature)。在Tm时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其G＋C所占总碱基数的百分比成正相关。 一般DNA Tm 值在85 - 90 ?C之间。 增色效应(hyperchromic effect)：指DNA变性后其紫外吸收明显增加的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260 nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入螺旋内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% 实质：碱基暴露 DNA的变性在紫外吸收上的变化 1.37倍 Hyperchromic effect 增色效应 1 OD260 DS DNA 50 ?g SS DNA 37 ?g RNA 40 ?g 不同来源DNA的变性曲线 盐浓度对DNA变性的影响 DNA分子的Tm与GC含量有关 （1）DNA的均一性 （2）G－C含量： 经验公式： XG+C＝（Tm－69.3）×2.44 或 Tm = 69.3+0.41(G +C)% （3）介质中的离子强度 DNA的复性： 指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性(renaturation)，此过程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。 DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响： 1、温度和时间：比Tm 低20-25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。 2、DNA浓度：溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。 3、DNA顺序的复杂性：简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。顺序复杂的序列要实现互补则困难得多。 DNA浓度与复性时间的关系 T1/2 × C ＝ const Cot Analysis Cot analysis was first developed and utilized in the mid 1960s by Roy Britten, Eric Davidson, and assoc