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单克隆抗体技术 第五节 细胞分子生物学研究方法 一、限制性内切酶：分子刀 二、凝胶电泳：分离DNA分子 三、聚合酶链反应技术：体外DNA扩增 四、基因（DNA）克隆 五、DNA测序 六、分子杂交技术： 七、蛋白质表达技术 八、生物芯片技术 二、凝胶电泳 三、Polymerase chain reaction, PCR 反应体系： 缓冲液、待扩增DNA模板、dNTP、Mg2+、引物、耐热DNA聚合酶。 步骤： 变性、退火、延伸 应用： 克隆基因、疾病诊断 步骤 高温变性 低温退火 引物延伸 引物 DNA polymerase 20~30个循环 四、基因（DNA）克隆 基因组DNA克隆 基因文库（gene library）：包含人染色体的全部基因的克隆。 cDNA克隆 cDNA：将mRNA通过逆转录酶合成的与mRNA互补的DNA单链。 五、DNA测序 1 2 六、hybridization 杂交技术 DNA变性与复性（杂交） 探针（marked probe）：带有标记物的已知核苷酸序列。 Northern blot ：对RNA的分析 Southern blot：对DNA的分析 In situ hybridization：核酸的细胞定位分析 In situ hybridization 步骤： 组织细胞或染色体的固定和置片 预处理：除去蛋白质、DNA变性 标记探针 杂交 检测 八、生物芯片技术 信息芯片 DNA芯片、蛋白质芯片等 功能芯片 END （1）超薄切片术 固定：锇酸 脱水：递增浓度 包埋：环氧树脂 切片：40～50nm 染色：醋酸铀 （2）冷冻制样技术 快速冷冻固定：104 ℃ /s 致冷剂：液氮（liquid nitrogen, -196℃）、氟利昂 （3）负染色技术（negative stain） 磷钨酸（4倍标本密度） （4）真空镀膜技术 replica and shadowing technique 碳膜和金属（Pt）膜 （5）冷冻蚀刻技术 冷冻： 断裂： 蚀刻：冰升华 复型： 剥膜： oocyte surface （6）扫描电镜样品的制备 固定 干燥（临界点干燥法） ：临界状态（临界温度和压力）下，固液两相界面消失，气体不会液化。含水标本在临界状态后缓慢放气减压，水分会气化干燥。 复膜 三、X射线衍射技术 五、活细胞内分子检测技术 膜片钳技术 向细胞内导入分子的技术 显微注射法 电休克法 脂质体导入法 转染法导入DNA 六、扫描探针显微术（Scanning Probe Microscope） 基本原理 基本结构 应用 纳米生物学研究,在原子水平上揭示样本表面的结构。 DNA、蛋白质分子结构的研究 SPM的基本原理 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 如： 原子力显微镜：AFM 模式 扫描隧道显微镜：STM 模式 磁力显微镜：MFM模式 电力显微镜： EFM模式 Scanning Tunneling M, STM CO O SPM的基本结构 扫描装置 探针 探针位移传感器 其他 第二节 细胞培养技术 一、细胞分离技术 离心法 吸附法 流式细胞技术 激光显微切割 二、细胞培养技术 体外细胞培养技术 细胞株的建立 细胞融合技术 胚胎干细胞培养技术 流式细胞技术（Flow cytometry） 结构及其工作原理 细胞流动室 光源和聚光装置 信号检测器 计算机系统 应用 细胞分选（cell sorting） 参数分析 （一）体外细胞培养技术 原代培养（primary culture）： 从机体取出后立即进行的培养。 传代培养（secondary culture/subculture）： 将原代培养的细胞从培养瓶取出后进行的培养。 细胞系（cell line）：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系 实验室中常用的几种细胞系 细胞系名称 细胞类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 HeLa 宫颈癌上皮细胞 人 BHK21 成纤维细胞 叙利亚仓鼠 PtKl 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 大鼠 SP2 浆细胞 小鼠 SP2／0 骨髓瘤浆细胞 小鼠 CHO 卵巢细胞 中国地鼠 （二）细胞株的建立 细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 （三）细胞融合技术 细胞融合(cell fusion) 融合 异核细胞 杂种细胞 单克隆抗体（Mon