81分子生物学技术.ppt

分子生物学常用技术 2、 核酸的理化性质 ◆晶形 DNA为白色纤维状固体 RNA为白色粉末状固体 ◆两性解离 呈酸性 在中性溶液中带负电荷 ◆溶解性 均溶于水 不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀 0.14M Nacl 1-2M Nacl DNA-蛋白 溶解度低 溶解度高 RNA-蛋白 溶解度高 溶解度低 ◆DNA和RNA对酸或碱的耐受程度 DNA耐弱碱 ◆酶水解 DNA水解酶（DNases）:以DNA为底物，最适pH7.0,需要Mg2+ RNA水解酶（RNases）:以RNA为底物，不需要任何辅助因子 3、DNA的提取 ◆原则 保证结构的相应完整性(避免高温和机械张力) 尽量排除其它大分子成分的污染 不含对酶的抑制剂 ◆过程 破 膜：SDS 去除蛋白质：蛋白酶K降解，SDS或其他变性剂（有 机溶剂），盐析等 去 除 RNA：RNAase或浓盐 沉 淀 DNA：乙醇沉淀 溶 解 DNA：水或TE ◆取动物组织100mg左右于样品管中,用干净的剪刀将组织块剪碎。 ◆在样品管中加入500μl TE (pH8.0)溶液,25μl 蛋白酶 K(10mg／ml）,75μl 10％ SDS，5μlRNAase（1mg/ml） ◆混匀后置56℃下消化2 小时以上（隔一定时间混匀一次）。 ◆加入等体积的饱和酚(pH8.0)溶液，轻轻颠倒混合10分钟 ◆12000r／min 离心10分钟。 ◆小心将上层清液移至另一干净的离心管中,加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混合10分钟 ◆ 12000r／min 离心10分钟。 ◆小心将上层清液移至另一干净的离心管中以等体积的/氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混合10分钟 ◆小心将上层清液移至另一干净的离心管,加2倍体积的冷无水乙醇 ◆12000r／min 离心10 分钟，弃上清 ◆再以70％冷乙醇洗涤DNA 沉淀一次。 ◆将沉淀置真空干燥器或37℃温箱中干燥 ◆以适量的TE 溶液（200～500μl）溶解DNA 样品。 ◆取2μl 左右的样品进行电泳检测 ◆取适当体积抗凝血,加入2倍体积红细胞裂解液,涡旋涡30秒； ◆10000-20000rpm离心1分钟，弃红色上清； ◆加入3倍于全血体积的红细胞裂解液，涡旋重沉淀； ◆10000-12000rpm离心30秒,弃红色上清,重复操作至沉淀为白色； ◆加入200?l核裂解液和50 ?l 10%SDS，用枪头搅散沉淀； ◆加入150?l核裂解液、10ul 20mg/ml proteinase K，混匀； ◆65℃水浴2小时以上或50℃消化过夜； ◆加入1/3体积的5.3 M NaCl高速离心（12000rpm）离心10分钟； ◆转移上清至新离心管； ◆加入2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀（可见絮状沉淀）； ◆高速离心（12000rpm）15分种，弃上清； ◆75%乙醇洗涤沉淀，高速离心（12000rpm）5分种，弃上清； ◆室温凉干，加入适当体积0.1xTE溶解沉淀；-20℃储存； 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－煮沸法 动植物总RNA提取-Trizol法 ◆ Trizol是由酚与异硫氰酸胍组成的均相溶液。 寡聚（dT）-纤维素柱层析法利用mRNA 3′端含有Poly（A+）尾巴 的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 5、核酸的检测问题 电泳检测 观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。 二 、电泳技术 按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为: 平板式电泳: 支持物水平放置,是最常用的电泳方式; 垂直板电泳: 聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳. 柱状(管状)电泳: 聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳. 琼脂糖电泳 不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围