《DuoFlow_层析系统简明使用教程》.pdf

BioLogic DuoFlow 层析系统简明使用教程 DuoFlow 层析系统 一、 仪器名称：BioLogic DuoFlow 层析系统 二、 规格型号：DuoFlow 10/40，QuadTec 10/40，Maximizer 20/80，Pathfinder 20/80 三、 生产厂家：Bio-Rad Laboratories, Inc 四、 产品简介 随着生命科学研究进入后基因组时代，以蛋白质为主要对象的研究成为各实验室研究的主 题，其中，对单个蛋白质的分离纯化是蛋白质研究的基础工作，也是非常重要的工作。对纯度均 一蛋白质的研究是揭示生命规律的重要手段，也是新药研发的必要途径，因为只有获得一定量的 蛋白质纯品，才能满足结构和功能的分析、物理化学参数测定、生物活性、毒理和药理实验等等， 乃至大量制备用于诊断和治疗。 蛋白质分离纯化的重要问题是如何在纯化过程中保持温和的条件，从而保证在此过程中蛋白 质的结构和活性不受影响。层析技术（Chromatography ）为蛋白质纯化提供了这样的条件，大都 在室温或低温下操作，所用的流动相可以是与生理液相似的具有一定 pH 值、离子强度的缓冲水 溶液，所用的填料表面修饰各种基团，可与蛋白质分子温和接触，从而保持了蛋白质分子的原有 构象和生物活性。层析系统以及各种分离纯化所需的填料和层析柱是保证该纯化过程的稳定性、 重现性和自动化进行所必需的设备。 五、 技术原理 将一种混合物分成单个组份是一个熵减的过程，故外界必须要给此过程提供能量。如下图所 示，完整的层析系统主要包含泵、各种阀门、层析柱、各种在位检测器和收集器。 泵 层析柱 阀门 检测器 组分收集器 其主要过程是：由泵推动溶液；各种阀门控制溶液流向，或者进样，或者洗脱层析柱；样 品经过层析柱并洗脱后，以样品各组分在流动相和固定相（层析介质）中的分配系数不同而保 留不同，从而分开；不同组分经过各种在位检测器，如紫外检测器、电导检测器、pH 检测器等 确定各组分的位置和浓度；最后各组分由收集器自动收集。 其中，泵是层析系统的心脏，用以推动溶液流动，DuoFlow 的泵是双柱塞双泵，可提供精 确稳定，双向变速可调的液流，并可根据层析柱的不同而提供一定的压力。检测器是层析系统 的眼睛，必须具有足够的灵敏度。在层析中需要检测的指标有 pH,离子强度，紫外/可见光吸收 值，折光度，荧光值等。 层析系统为层析技术及其过程提供了稳定、准确、可靠的自动化平台，而各种层析介质和 层析柱则是层析技术的核心。各种层析技术简介如下： 1、离子交换（ion exchange chromatography, IEC ）：利用蛋白质在一定缓冲液和pH 条件下不同蛋 白质具有彼此不同的电荷数目，从而与离子交换层析介质上的配基的相互作用不同，以不同离子 强度或连续离子强度梯度的盐溶液将结合能力不同的蛋白质依次洗脱下来。蛋白质与离子交换介 质之间的相互作用方式是多种多样的，不仅与蛋白质所带的净电荷有关，而且与蛋白质分子的空 间结构和电荷分布等因素有关，每一种蛋白质具有其独特的性质，因此，在分离制备蛋白质时要 选择不同的介质和不同的条件，主要有层析介质及其孔径和载量，如 UNOsphere Q/S ，MacroPrep High Q/S, DEAE 和 CM 等，层析条件主要有缓冲液、pH 值、离子强度等等。 2 、凝胶过滤(Gel Filtration Chromatography，GFC) ：一种纯粹按蛋白质分子在溶液中的体积大小 分离的层析方法，层析介质具有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出层析柱，小分子后流 出。 3、羟基磷灰石层析（CHT ）：具有独特的分离机理，是唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层 析填料，高度耐碱，生物安全性最高。其中PO43-离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子 交换特