《茶叶中咖啡因的HPLC分析》.docVIP

茶叶中咖啡因的高效液相色谱分析 一、实验目的： 了解反相色谱的原理和应用 掌握标准曲线定量法 二、实验原理： 咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。其分子式为C8H10O2N4，结构式： 样品在碱性条件下，用氯仿定量提取，采用反相液相色谱柱进行分离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作工作曲线，再根据样品中的咖啡因面积，由工作曲线算出浓度。 实验仪器与药品 ⑴仪器 Waters2695型高效液相色谱仪 操作软件 色谱柱（EconosphereC18） 自动进样器 ⑵药品 甲醇（色谱纯） 双蒸水 氯仿（A.R） 1mol/LNaOH; NaCl(A.R.) Na2SO4(A.R.) 咖啡因（A.R.） 茶叶 ②1000mg/L咖啡因储备液 将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g咖啡因，用氯仿溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。 四、实验步骤： ⑴ 色谱条件： 柱温：室温 流动相：甲醇／水＝60：40 流量：1.0mL/min 检测波长：275nm ⑵ 咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40mL咖啡因储备液于六只容量瓶中，用氯仿定容至刻度，浓度分别为40、60、80、100、120、140mg/L ⑶ 样品处理： ① 准确称取茶叶0.3g,加蒸馏水30mL煮沸10min，冷却后将清液转移至100mL容量瓶，并按此操作重复两次，定容至刻度。将3份样品溶液分别进行干过滤，弃去前过滤液，取后面的过滤液。 ②分别取上述三份样品溶液25.0mL于125mL分液漏斗中，加饱和氯化钠溶液，溶液，然后用氯仿分三次萃取。将氯仿提取液分离后经装有无水硫酸钠小漏斗，过滤至容量瓶中，最后用少量氯仿多次洗涤小漏斗，定容至刻度。 ③绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液10μl，重复两次，要求两次所得的咖啡因色谱峰面积基本一致，记下峰面积与保留时间。 ④样品测定：分别注入样品溶液10μl，根据保留时间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，重复两次，记下咖啡因色谱峰峰面积。 五、结果处理： ⑴根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。 ⑵根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线计算茶叶中咖啡因含量（分别用mg/L、mg/g和mg/g表示） 六、注意事项： ⑴液体样品必须经过萃取处理，不能直接进样，虽然操作简单，但会影响色谱柱的寿命。 ⑵不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取样品可酌量增减。 ⑶若样品和标准溶液需要保存，应置于冰箱。 ⑷样品和标准的进样量要严格保持一致。 七、思考题： ⑴用标准曲线法的优点是什么？ ⑵根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？ ⑶若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？ ⑷在样品干过滤时、为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？