《rhIL-12二硫键、N-糖基化位点及C端氨基酸序列分析》.pdf

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2014，34(5)：39-53 DOI：10．13523／j．cb rhIL一12二硫键 、N一糖基化位点及 C端氨基酸序列分析水 赵 峰 张宜俊 冉艳红 王兴勇 叶倩君 李弘剑 (1暨南大学生命科学技术学院 广州 510632 2广州市恺泰生物科技有限公司 广州 510663) 摘要 重组人白细胞介素 12(rhlL．12)是一种已经用于治疗肿瘤，寄生虫、病毒性感染及造血障碍 等疾病研究的异二聚体糖蛋 白。结构确证是质量控制的重要 内容，此研究对CHO细胞表达的 rhlL一12二硫键配对方式、N．糖基化位 点以及 C端氨基酸序 列进行 了分析，使用 Trypsin、 Chymotrypsin和Glu—C三种酶分别对rhIL．12进行非还原酶解，尽可能地在其所有半胱氨酸残基之 间断裂而形成二硫键相连的肽段，然后使用LC—MS／MS对酶解后的肽段样品进行分析，确定了 rhIL一12样品中存在和理论配对方式相符的7对二硫键。将rhlL-12二硫键还原后并烷基化修饰 保护，分别采用Trypsin，Chymotrypsin和GluC进行酶解，并用LC—MS／MS对酶解后肽段进行了质 谱肽图及c端氨基酸序列分析，确定了rhlL一12p35亚基 c端氨基酸序列的8个氨基酸、p40亚基 C端氨基酸序列的 15个氨基酸。对 rhlL一12样品还原及烷基化后用Trypsin变性酶解 ，所得肽段 在 H2O及H2埔O水中分别用PNGaseF糖苷酶处理酶切产物。并通过二级质谱分析脱糖后糖肽 段分子量变化，从而确定了rhIL．12的3个N糖基化修饰位点，分别为p35亚基的71位和85位 以 及p40亚基的200位。通过建立酶解结合二级质谱鉴定的方法，证明了新药rhlL一12的二硫键位 点、C端氨基酸序列和糖基化位点与理论一致。 关键词 rhIL．12 二硫键 N．糖基化位点 C端氨基酸序列 LC—MS／MS 中图分类号 Q517 目前，已经有许多生物技术生产的糖蛋白在临床 检定项 目中没有规定，但是在 申报注册药物时在质量 上发挥重要的作用，这些多数是 CHO细胞表达的糖蛋 研究中应尽可能分析清楚。 白，对糖蛋白的理化特性分析是保证产品质量的重要 IL．12是由两个不同基因编码的蛋白亚单位组成 内容。糖蛋白中的糖基化对其生物学功能起着非常重 的异源二聚体蛋白。IL一12040和IL．12p35两个亚单位 要的作用。其中糖基化位点的鉴定分析是糖基化分析 通过二硫键相连，构成具有生物学功能的IL-12：p70。其 的重要组成部分，这有助于进一步揭示糖蛋白的生物 中400由306个氨基酸组成，包含 10个半胱氨酸残基 学特性，以及产品质量控制方面起着重要的作用。基 和4个潜在的N-糖基化位点。p35由197个氨基酸组 因工程药物的氨基酸序列与二硫键配对是否正确与蛋 成，包含 7个半胱氨酸残基和3个潜在的N．糖基化位 白质的生物活性也具有密切相关性，尽管在质量控制 点…。目前 IL．12是免疫网络中重要的核心细胞因子， 中对二硫键配对分析以及 c端氨基酸序列分析在常规 是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的桥梁，它可 诱导Th0分化 ，并通过 NK细胞、T细胞增殖和发挥细 收稿 日期：2014-03-11 修回日期：2014-04-08 十国家科技部中小企业创新基金资助项 目(1Oc26214414767) 胞毒性作用以及诱生IFN．^y从而增强机体的细胞免疫 +十通讯作者，电子信箱：tlihj@jal1．edu．ca 功能 J。而在骨髓中，间充质干细胞也能分泌 IL一12作 40 中