《果梅PmKNAT2基因全长cDNA克隆及表达分析》.pdfVIP

中国农业科学 2014，47(17)：3444—3452 ScientiaAgriculturaSinica doi：10．3864~．issn．0578—1752．2014．17．012 果梅 PmKNAT2基因全长 cDNA克隆及表达分析 孙海龙，宋 娟，高志红，倪照君，章 镇 (南京农业大学园艺学院，南京 210095) 摘要：【目的】从 大‘嵌蒂’果梅中克隆PmKNA]2，并对其结构特征及表达模式进行分析，为研究果梅雌蕊败 育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2(KNAT2的同源基因) 序列 (EF093491)，根据桃的KNOPE2序列设计特异 §J物；采用改良CTAB法提取 大‘嵌蒂’果梅花芽总RNA；通过 RT—PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长；使用DNAMAN软件进行序列拼接；利用NCBI数据库中的BLASTn和 BLASTp程序进行相似性分析；通过生物信息学方法分析结构特征；用DNAMAN软件分析基因的0RF和氨基酸序列； MEGA4．0软件进行系统进化树的构建；利用 Bioxm2．6推测分析蛋白分子量和等电点；根据 NCBI中 Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测；用 ExPaSy提供的在线 SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测；构建 PJIT166一PmKNAT2一GFP的融合亚细胞定位表达载体，采用基因枪法转化洋葱表皮细胞，经暗培养后在激光共聚焦 显微镜下观察；利用实时荧光定量RT-PCR研究其表达模式，分析其在 大‘嵌蒂’花芽发育不同时期、不同器官中的 表达特性。【结果】在 大‘嵌蒂’果梅中获得一个XNA72的同源基因，命名为PmKNA72，其cDNA全长为 1402bp，5UTR 47bp，3UTR293bp，编码区全长为 1062bp，编码 353个氨基酸，预测蛋白质分子量为 40．41kD，理论等电点 为4．85。蛋白结构分析表明该基因编码的氨基酸具有2个结构域，MEINOX结构域 (KNOXI和KNOXII2个亚结构域) 和HD(homomeodomain)结构域，属于KNOX蛋白；相似性分析发现该基因与GenBank中其它来源的KNOX蛋白序列的 相似性为50％一1O0％；系统进化树分析显示果梅PmKNA22与桃KNOX聚为一类，表明与其亲缘关系最近 二级结构预 测结果表明PmKNA72所编码蛋白由47．14％的 一螺旋 (Alphahe1ix)、3．43％的p一转角 (Betaturn)、3．14的p一折 叠 (Extendedstrand)和46．29％的随机卷曲 (RandomCOil)组成。亚细胞定位结果显示该基因编码的蛋白定位于 细胞核和细胞膜中。实时荧光定量RT-PCR分析表明，在 大‘嵌蒂’果梅不同时期花芽中PmXNA72的表达量存在一定 差异，PmENA]2在I1月份的表达量最高，9月、10月和 11月的表达量差异不明显，但与12月和 1月花芽中的表达 量差异明显；生长素在 1月份含量最高，9、10、11月份差异不明显，其含量变化趋势与PmKNA72表达趋势相反 对 该基因表达量最高的i1月份的花芽进行实时荧光定量分析发现：PmKNAT2在各种花芽中均有表达，在不完全花 (雌 蕊褐色、雌蕊畸形和无雌蕊)中的表达量高于完全花 (雌蕊正常)。进一步分析PmKNA72在完全花与不完全花的不同 花器官中的表达量，结果表明PmKNAT2在完全花与不完全花的各部位的表达量趋势相似均为：萼片雄蕊花瓣，在 完全花雌蕊中的表达量最低。【结论】推测PmKNA]2在雌蕊发育阶段的异常表达可能与 大‘嵌蒂’果梅雌蕊败育有关。 关键词：果梅；雌蕊败育；PmKNAT2；基因克隆；特征分析；表达模式 IsolationandExpressionAnalysisofPmKNAT2GenefrOm JapaneseApricot SUNHai—long，SONGJuan，GAOZhi—hong，NIZhao-jun，ZHANGZhen