三羟异黄酮调控肝脏UGTs活性机理和研究.pdfVIP

致 谢 本论文能顺利完成，首先要感谢范远景教授的悉心指导，无论是在实 验思路上还是在实验技术上，无不倾注了范老师的心血。在平时生活中， 范老师一直教育我们，做事先做人的道理。这三年来，在实验室所学，将 是我人生中重要的一笔财富。 同时，我要感谢董万领师兄，他对实验的前期工作为我的实验奠定了 很好的基础。我还要感谢我们实验室的师兄师姐王林、张东吟、谢玄，是 他们在我刚进入实验室，对实验不熟悉的时候，细心教会我实验技术。衷 心感谢张瑞在实验中给予我很大的帮助，在各方面给予我精神上的支持和 鼓励。我们在三年的学习生活过程中建立了深厚的友情，是我应该永远珍 惜的财富。衷心感谢我的学妹张铃、曹迪，我实验中的不少辅助工作都是 由她们完成的。 最后，感谢我的父母及家人一直以来给予我的支持，你们是我最坚实 的后盾和港湾，也感谢我的女朋友程丹，感谢这几年来，包容我支持我。 此外，论文中还引用了大量的珍贵文献和学术观点，在此一并表示感 谢！ 作者：李鹏飞 2013年4 月 三羟异黄酮调控肝脏UGTs 活性机理研究 摘要 目的：三羟基异黄酮（Gen ）是一种广泛存在于大豆等豆科植物中的次级代 谢产物，研究发现其具有抗癌、抗氧化等多种生物学功能。尿苷二磷酸葡萄糖醛 酸转移酶(UGTs)是一类存在于动物肝脏中的重要的Ⅱ相代谢酶，能够催化肝脏代 谢解毒作用，本文研究了Gen 通过诱导肝脏UGTs 酶活从而促进肝脏解毒效果的 作用及其作用机理。 方法：利用对乙酰氨基酚（APAP ）诱导肝损伤小鼠模型进行三羟基异黄酮 肝脏保护实验，通过检测小鼠肝脏丙二醛（MDA ）含量、肝脏总抗氧化能力 （T-AOC ）、血清谷氨酸氨基转移酶活(ALT) 、肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活 (GSH-Px) 、肝脏与血清中的谷胱甘肽(GSH)含量等生化指标对Gen 对APAP 诱导 小鼠肝损伤的保护作用进行评价；利用经过 Gen 处理后的小鼠肝脏制备微粒体 并进行体外孵育实验，以4-MU 为底物检测微粒体中UGTs 酶的活性，并进一步 进行了APAP 在体外微粒体孵育反应中的酶促转化检测；人体细胞实验利用MTT 法检测了APAP 对受不同浓度Gen 保护的人肝癌细胞Hep G2 、Hep 3b 以及人正 常肝细胞L-02 的活性影响；利用实时荧光定量PCR 检测Gen 对三种细胞中UGTs 同工酶UGT1A1 、 UGT1A6 、UGT1A9 及核转录相关因子（Nrf2 ）和Kelch 样 ECH 联合蛋白1 （Keap1 ）的mRNA 的表达的影响，进一步探讨Gen 诱导UGTs 活性表达以及作用机理。 结果：（1）与模型组比较，Gen 诱导后的实验组小鼠肝脏MDA 水平、血清 ALT 水平显著降低，肝脏 T-AOC 、肝脏GSH-Px 活性显著增高，且表现有剂量 依赖效应；Gen 诱导组小鼠的肝脏及血清中 GSH 恢复速度高于模型组，24h 后 高、中剂量组的肝脏及血清GSH 能恢复到对照正常水平；（2 ）Gen 可以上调肝 脏中UGTs 的活性，并且能够提高APAP 在体外孵育反应中的代谢转化率；（3 ） Gen 能提高细胞对APAP 毒性的抵抗能力，减轻APAP 对细胞的损伤作用；Gen 显示出上调UGT1A1 、UGT1A6 、UGT1A9 及Nrf2 的mRNA 的表达量，下调Keap1 表达的作用。 结论：Gen 对由APAP 所致肝脏损伤的小鼠有一定的保护作用。Gen 保护作 用机制可能与诱导上调代谢 APAP 的主要 II 相代谢酶 UGT1A1 、UGT1A6 、 UGT1A9 等同工酶的表达，增加UGTs 的活性有关；Nrf2 及Keap1 mRNA 表达 量的分别增加和降低指示Gen 可能通过激活Keap1-Nrf2/ARE 途径调节II 相代谢 酶UGTs 、氧化还原酶的活性表达，增强体内抗氧化胁迫、促进外源化合物代谢 转化的解毒保肝生