《两步多重RT—PCR快速检测苹果潜隐性病毒》.pdfVIP

果 树 学 报 2012，29(4)：695～701 Journa1ofFruitScience 两步多重 RT—PCR快速检测苹果潜隐性病毒 陈红霞，邵建柱 ，孙建设 ，曹晓凤，乔雪华 (河北农业大学园艺学 院，保定071000) 摘 要：【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法，方【法】以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪 绿 叶斑病毒 (ACLSV)和苹果茎痘病毒 (ASPV)的成龄苹果树韧皮部为试材 ，根据基 因库 中苹果茎痘病毒 (Applestem pittingvirus．ASPV)的外壳蛋白基因序列，设计合成 了2对特异性引物 ，分别与合成 的苹果茎沟病毒 (ASGV)引物和 苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)的引物组合配伍 ，筛选 出最佳 的引物对组合。对 cDNA的合成所用引物和总RNA模板进 行遴选和量化，对 PCR过程中cDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。 【结果】结果表 明，反转录引物为 Oligo(dT) 总 RNA0．1～3．0 L时 ，可 以得到较好的 cDNA；ASPV—FR与 ASGV—Pch、ACLSV—Pch 引物组合优于 ASPV—Pch，并且筛选 出4组最佳 的终浓度处理组合 ；cDNA用量为 2．0—4．0 L、退火温度为50．0～52．9 ℃、循环数为35时 ，扩增效果较好 。采用优化 的多重 RT—PCR体系对采 自陕西和山东两省的样 品进行检测 ，并用 3 种病毒的单重RT—PCR体系进行验证。 【结论】结果呈现高度一致性，充分印证了该多重RT—PCR体系的准确性 ，适 用于大量样品的快速检测。 关键词 ：苹果病毒 ；苹果茎沟病毒 ；苹果茎痘病毒；苹果褪绿叶斑病毒；两步多重 RT—PCR 中图分类号：$661．1 文献标志码：A 文章编号：1009—9980(2012)04—0695—07 Quickdetectionofapplelatentvirusesbytwo-stepmultiplexRT-PCR assay CHENHong-xia，SHAOJian—zhu，SUNJian—she，CAOXiao—feng，QIAOXue—hua (CollegeofHorticulture，Agricultura]UniversityofHebei，Baoding071000China) Abstract：[Objective]Theobjectiveofthestudyistofindafastermethodfordetectingthreeapplelatent virusesaccurately． M【ethod】TakingthephloemofmatureappletreesinfectedbyApplestemgrooving virus(ASGV)，Applestempittingvirus(ASPV)andApplechloroticle spotvirus(ACLSV)asmateri- als，thespecificprimersofASPV—FRweredesignedaccordingtothecoatproteingenesequencesofAS— PV(Applestempittingvirus)inGenebank，andtheprimersetsofASGV-Pch，ACLSV-PchandASPV- Pchweresynthesizedaccordingtothereferences．TwopairsofspecificASPVprimerswererespectively combinedwithASGV—PchandACLSV—Pchofrscreeningoutthebestcombination．Theprimeroffirst- strandcDNA synthesisandthetotalRNA amountweretested．TheamountofcDNA，thefinalconcentra— tionofthreesetsprimers，theannealingtemperatureandothermajorfactorsaffectingthetestwereopti- mi