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分子生物学实验理论与操作教程 分子生物学实验理论与操作教程 分分子子生生物物学学实实验验理理论论与与操操作作教教程程 分子生物学实验理论与操作教程 分子生物学实验理论与操作教程 分分子子生生物物学学实实验验理理论论与与操操作作教教程程 中国农科院研究生院 中国农科院研究生院 中中国国农农科科院院研研究究生生院院 中国生化及分子生物学学会 中国生化及分子生物学学会 中中国国生生化化及及分分子子生生物物学学学学会会 植物病虫害生物学国家重点实验室 植物病虫害生物学国家重点实验室 植植物物病病虫虫害害生生物物学学国国家家重重点点实实验验室室 二零零四年七月 二零零四年七月 二二零零零零四四年年七七月月 目 录 前 言 --I 第一部分 核酸提取 -1 实验一：基因组DNA提取 --1 实验二：总RNA提取 --3 第二部分 亚克隆技术 --8 实验三：质粒DNA提取 --8 实验四：DNA片段的酶切 -9 实验五：DNA片段的酶修饰-脱磷 -12 实验六：DNA片段的连接 -13 实验七： DNA片段的回收 -15 第三部分 PCR技术 -18 实验八：PCR产物的克隆技术 -18 八．1：T-载体构建 --19 八．2：PCR产物的T-载体克隆 --20 八．3：PCR产物的平端克隆技术 -21实验九：RT-PCR技术 21 实验十：定量PCR -25 第四部分 文库构建技术 -29 实验十一：mRNA的提取及纯化 -29 实验十二：cDNA文库构建技术- cDNA 链的反转合成 -32实验十三：1,cDNA文库构建技术- cDNA 链的连接、包装及转染 34 实验十三：2,RACE技术 -36 第五部分 核酸杂交技术 -40 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm 实验十四：DNA探针的标记 -40 实验十五：Southern杂交技术 -44 第六部分：基因及基因产物检测技术 --48 实验十六：DNA的测序技术 -48 实验十七：基因表达 1，基因的体外快速翻译 -53 2，基因的诱导表达 -54 实验十八：报告基因的应用 --57 实验十九：Western杂交技术 -58 第七部分 基因表达轮廓技术 -67 实验二十：DD-PCR技术 -73 实验二一：SSH技术 -74 第八部分：遗传转化技术 -75 实验二二：感受态细胞制备 -75 实验二三：重组基因的转化及筛选 --77 实验二四：原生质体分离 --78 实验二五：农杆菌转化技术 --79 第九部分：分子标记技术 --80 实验二六：RFLP技术 -86 实验二七：RAPD技术 -86 实验二八：AFLP技术 -87 实验二九：SSR技术 -89 第十部分：细胞技术 -89 实验三十：细胞凋亡 --89 十一：附录 一 --92 二 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm --96 第一部分 核酸提取 目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。对于序列已知或部分 已知的寡聚核苷酸基因片断或基因可通过DNA的人工合成直接获取；或利 用PCR、RT- PCR及RACE技术，直接扩增出相应的基因片段；对于未知序 列的基因或基因片断利用dd-PCR等差异显示技术、转坐子标签技术、分 子标记技术、图位克隆及电子杂交等手段分离出相应目的基因或