家蚕吡哆醛激酶基因定点突变突变体功能及研究.pdf

摘要 维生素 B (VB )是一类吡啶化合物的总称，游离型为吡哆醇(pyridoxine, PN) 、 6 6 吡哆醛(pyridoxal, PL)和吡哆胺(pyridoxamine, PM) ，对应的磷酸酯型为磷酸吡哆 醇(pyridoxine-5-phosphate, PNP) 、磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate, PLP)和磷酸 吡哆胺(pyridoxamine-5-phosphate, PMP) ，其中 PLP 是 VB6 的主要辅酶形式，参 与氨基酸代谢的各种反应。吡哆醛激酶(pyridoxal kinase, PL 激酶)是 VB6 代谢途 径中的关键酶，在金属阳离子和 ATP 存在下，催化 PN 、PL 和 PM 分别形成 PNP 、 PLP 和 PMP 。PL 激酶与磷酸吡哆醇氧化酶、磷酸酶一起维持细胞内 PLP 浓度稳 定，在 VB6 代谢中发挥重要作用。 家蚕(Bombyx mori) 是蚕丝生产的重要经济昆虫，VB6 对蚕体氨基酸代谢、脂 肪酸代谢以及转氨酶活力的影响较大。家蚕发育过程中，伴随着蛋白质短期内的 大量降解和合成。当家蚕丝腺快速合成丝蛋白时，需要供给大量的氨基酸。桑叶 蛋白质中富含谷氨酸和天冬氨酸，转氨基作用在丝蛋白的合成过程中尤为显著。 PL 激酶是家蚕 VB6 转换代谢的关键酶，关系到丝蛋白合成的联动调解机制。 近几年，本实验室对家蚕 PL 激酶进行 cDNA 克隆、原核表达并初步分析了 酶学性质。前期研究克隆出家蚕吡哆醛激酶 cDNA，经序列比对发现几个重要且 保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。为明确家蚕 PL 激酶分子若干特定位置上 的氨基酸残基在酶活性功能上的作用进行本研究。采用重叠延伸法对家蚕 PL 激 酶 Thr47 ，Asn121，Ile54 ，Arg88 和 Trp230 氨基酸残基进行定点突变，构建表达载体 pET-22b-PL 激酶并转入 Escherichia coli Rosetta 中进行诱导表达，经亲和层析对 重组蛋白进行纯化，通过酶活力检测进行功能鉴定。家蚕 PL 激酶 Thr47 、Ile54 和 Arg88 氨基酸残基突变后酶催化活力分别下降 82%、58%和 85%；Asn121 突变 对酶的催化活力几乎没有影响；而 Trp230 突变导致酶丧失催化活性。 本研究明确了选定氨基酸侧链基团在家蚕 PL 激酶催化功能上的意义。有助 于进一步研究家蚕 PL 激酶的催化机制和结构与功能的关系。 关键词：家蚕，PL 激酶，定点突变，表达纯化，功能鉴定，酶活性 I Abstract Vitamin B6 is a kind of pyridine compounds, including the free forms of pyridoxine(PN), pyridoxamine(PM), pyridoxal(PL) and the phosphate forms of pyridoxine-5’-phosphate(PNP), pyridoxamine-5’-phosphate(PMP), pyridoxal-5’-ph- osphate(PLP). PLP acts as the essential coenzyme in many metabolic transitions of amino acids and participates in biosynthesis of some substance. In the presence of Zn2+ and ATP, pyridoxal kinase (PL kinase, EC 2.7.1.35), a key enzyme related to VB6 metabolism, catalyzes PN, PL and PM generating PNP,